周榮翔　李霽虹　張瑤　周婷婷　王雨婷　侯曉飛　馬桂珍

摘要：【目的】明確海洋細(xì)菌N-LY-1菌株的抑菌、促生作用及其促生機理，確定其分類學(xué)地位，為該菌株進一步開發(fā)為農(nóng)用微生物制劑提供參考?！痉椒ā恳郧捌趶慕K連云港海域鱸魚腸道內(nèi)分離獲得的海洋細(xì)菌N-LY-1菌株為材料，采用平板對峙法、牛津杯法及室內(nèi)盆栽試驗測定N-LY-1菌株對12種植物病原真菌的抑菌作用及其對黃瓜的促生防病作用;通過測定N-LY-1菌株的解磷、解鉀、固氮作用以及產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）和鐵載體能力，探明菌株的促生長作用機理;通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗和16S rDNA序列分析，對菌株進行種類鑒定。【結(jié)果】N-LY-1菌株及其無菌發(fā)酵液對供試的12種植物病原真菌的抑菌帶寬度均大于5.00 mm，均具有明顯的抑菌作用，其中，其無菌發(fā)酵液對蘋果輪紋病菌、小麥赤霉病菌、草莓灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、番茄早疫病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制作用較強，抑菌帶寬度在16.00 mm以上;其發(fā)酵液能促進黃瓜幼苗生長，在供試濃度范圍內(nèi)對黃瓜枯萎病的防治效果最高達81.5%;該菌具有固氮和解有機磷作用，能產(chǎn)生IAA和鐵載體。結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將N-LY-1菌株鑒定為海膽鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas echinoides）?！窘Y(jié)論】N-LY-1菌株是一株具有較強抑菌、防病及促進植物生長作用的海膽鞘氨醇單胞菌;固氮、解有機磷及產(chǎn)IAA和鐵載體是該菌株的促生作用機制。N-LY-1菌株具有進一步開發(fā)為農(nóng)用微生物制劑的潛力。

關(guān)鍵詞：海膽鞘氨醇單胞菌;N-LY-1菌株;抑菌機制;防病作用;促生作用;種類鑒定

中圖分類號：S476? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）03-0830-10

Study on agricultural function and activity of marine bacterium N-LY-1 and its species identification

ZHOU Rong-xiang LI Ji-hong ZHANG Yao ZHOU Ting-ting WANG Yu-ting HOU Xiao-fei MA Gui-zhen

（1Food Science and Engineering，Jiangsu Ocean University， Lianyungang， Jiangsu? 222005， China; 2 Zhangjiakou

Xuanhua Vocational and Technical Education Center， Zhangjiakou， Hebei? 075100， China）

Abstract：【Objective】To clarify the bacteriostasis， growth promoting effect and life promoting mechanism of marine bacterium N-LY-1， and determine its taxonomic status， so as to provide reference for the further development of this strain and agricultural microbial preparation. 【Method】Marine bacterial strain N-LY-1 isolated from the intestines of perch in Lianyungang sea area of Jiangsu Province was used as materials. The bacteriostatic effect of strain N-LY-1 on 12 plant pathogenic fungi and strain N-LY-1 growth promoting and disease controlling effect on cucumber were determined by plate confrontation method， Oxford cup method and indoor pot experiment. The growth promoting mechanism of strain N-LY-1 was explored by measuring its phosphorus， potassium and nitrogen fixation， indoleacetic acid （IAA） production and siderophores capacity. The strains were identified by morphological observation， physiological and biochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis. 【Result】N-LY-1 strain and sterile fermentation broth had obvious bacteriostatic effect on 12 plant pathogenic fungi， with the width of inhibitory zone greater than 5.00 mm. The fermentation broth had strong inhibitory effect on apple ring rot， wheat scab， strawberry gray mold， apple rot， tomato early blight and Cucumber Fusarium wilt， with the antibacterial band width more than 16.00 mm. The N-LY-1 fermentation broth could promote the growth of cucumber seedlings， and the control effect on Cucumber Fusarium wilt was up to 81.5% in the range of tested concentration. The strain had the function of nitrogen fixation， organic phosphorus reconciliation and IAA and siderophoresproduction.N-LY-1 strain was identified as Sphingomonas echinoides. Based on the colony morphological observation， physiological and biochemical characteristics and molecular biological identification. 【Conclusion】N-LY-1 strain， a Sphingomonas of sea urchin，has functions of bacteriostasis， disease prevention， plant growth promotion. Nitrogen fixation， organophosphorus decomposition and IAA and siderophores production form the growth promoting mechanisms of the strain. N-LY-1 strain has the potential to be further developed into agricultural microbial agents.

Key words： Sphingomonas echinoides; strain N-LY-1; bacteriostatic mechanism; disease prevention; growth promoting effect; species identification

Foundation items： Jiangsu Agricultural Science and Technology Innovation Fund Project〔CX（20）3133〕

0 引言

【研究意義】目前植物病害的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，長期使用化學(xué)農(nóng)藥引起病原微生物產(chǎn)生抗藥性、土壤環(huán)境惡化、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染及食品安全等問題，嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，威脅著人類和動物的健康（蔣晶晶等，2020）。生物防治彌補了化學(xué)防治的不足，具有對環(huán)境安全、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、兼防兼治、促生等優(yōu)勢（李恩琛等，2020），已成為植物病害防治的安全有效手段，分離篩選抑菌防病作用強、促生作用機理不同的新型微生物菌株是開發(fā)高效農(nóng)用微生物制劑的基礎(chǔ)。目前，用于微生物制劑開發(fā)的微生物主要有來自陸源的木霉菌（Trichoderma）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）和多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）等，細(xì)菌具有生長速度快、易培養(yǎng)、抗逆性強等特性，是重要的生防資源，其通過營養(yǎng)競爭、寄生、分泌拮抗性次級代謝產(chǎn)物及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等多種方式防治植物病害（張曉夢等，2020），并能產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸（IAA）和赤霉素等激素，合成有利于植物生長發(fā)育的物質(zhì)如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶細(xì)胞壁水解酶和抗菌蛋白等，間接或直接提高植物的質(zhì)量與產(chǎn)量（路兆軍等，2021）。但經(jīng)過長期篩選，從陸地得到新種類和新作用機制優(yōu)良菌株的概率越來越低，于是人們把目光轉(zhuǎn)向海洋，海洋環(huán)境的特殊性，使海洋微生物具有耐鹽、耐低溫、寡營養(yǎng)、易培養(yǎng)、發(fā)酵耗能低、適應(yīng)性廣和易于在不同環(huán)境中定殖等特性，研究海洋細(xì)菌的抑菌作用及其促生特性，可為農(nóng)用微生物制品提供新的菌種資源，具有重要的實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】不同學(xué)者從海洋環(huán)境中成功篩選出抑菌作用廣、抗逆性更強的枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等海洋微生物菌株，一些菌株已開發(fā)成微生物制劑，完成了農(nóng)藥或肥料的產(chǎn)品登記。聶亞鋒等（2008）從連云港海域分離到1株對水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）等4種植物病原菌具有抑菌活性的海洋細(xì)菌PY-sw-1;黃庶識等（2010）從北部灣海域分離到海洋細(xì)菌MF-3、MF-6和MF-13，3株細(xì)菌對水稻紋枯病菌均具有抑菌活性，其中MF-6具有較好的抑菌效果和廣譜性，有望研發(fā)成防治水稻病害的新型農(nóng)藥;Fang等（2012）從南大洋海域分離篩選出3株能抑制水稻紋枯病菌和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等7種植物病原菌的海洋細(xì)菌;張靖宜等（2014）自黃渤海海域的雙齒圍沙蠶中分離到1株對水稻紋枯病菌和小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）具有抑制作用的內(nèi)生放線菌SCF-18，具有潛在的開發(fā)價值。江蘇海洋大學(xué)海洋抗菌微生物研究室（以下簡稱本實驗室）從連云港海域分離到對黃瓜枯萎病菌（F. oxysporum）、小麥赤霉病菌（F. graminearum）和水稻紋枯病菌等多種植物病原菌具有強烈抑制作用，并能促進黃瓜等植物生長的多粘類芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌GM-1、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）BMF04和栗褐連霉菌（Streptomyces badius）BM-2等多個優(yōu)良海洋微生物菌株（葛平華等，2013;馬桂珍等，2014;汪晶晶等，2015;萬丹丹等，2020），其中L1-9、BMF 03和BMF 04等菌株分別開發(fā)出了可濕性粉劑（陳茹等，2020），2個水懸浮劑（馬桂珍等，2021a，2021b）獲得國家發(fā)明專利?！颈狙芯壳腥朦c】N-LY-1菌株是本實驗室從江蘇連云港海域高公島鱸魚腸道內(nèi)分離獲得的海洋細(xì)菌，但有關(guān)該菌株的抑菌、促生作用及其機理和種類鑒定尚未開展相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用平板對峙法、牛津杯法及室內(nèi)盆栽試驗測定N-LY-1菌株對12種植物病原真菌的抑菌作用及其對黃瓜的促生防病作用，明確其促生作用機理，并對N-LY-1菌株進行種類鑒定，為該菌株進一步開發(fā)為農(nóng)用微生物制劑提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試菌株：海洋細(xì)菌N-LY-1菌株，由本實驗室從連云港海域高公島鱸魚腸道內(nèi)分離獲得;甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）BMF 03、大腸桿菌（Escherichia coli）82000、屎腸球菌（Enterococcus faecium）R-1、膠紅酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）SYM-1及12種植物病原真菌[黃瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌（Physalo-spora piricola）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）、月季黑斑病菌[Actinonema rosae（Lib） Fr.]、梨輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、玉米彎孢霉葉斑病菌（Curvularia lunata）、玉米葉枯病菌（Alternaria tenuis Nees）、蘋果腐爛病菌（Cytospora sp.）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae Cav.）和番茄早疫病菌（Alternaria solani ）]均由本實驗室保存。供試培養(yǎng)基：N-LY-1菌株、黃瓜枯萎病菌活化及培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基，N-LY-1菌株種子液和發(fā)酵液用PD培養(yǎng)基。供試黃瓜品種為津正A206（綠哼科技股份有限公司）。

1. 2 N-LY-1菌株種子液、發(fā)酵液及無菌發(fā)酵液制備

將培養(yǎng)18 h的N-LY-1菌株用PD培養(yǎng)基洗下，接入裝有60 mL PD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，調(diào)整濃度為108 CFU/mL，作為發(fā)酵用種子液。

將種子液按10%的接種量接入裝有60 mL PD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，為發(fā)酵液，發(fā)酵液8000 r/min離心20 min，上清液用0.22 μm的細(xì)菌過濾膜過濾即為無菌發(fā)酵液。

1. 3 N-LY-1菌株及其發(fā)酵液對不同植物病原菌的抑菌作用測定

在PDA培養(yǎng)基中央劃線接種N-LY-1菌株，在其兩側(cè)距離2.5 cm處接種直徑為5 mm的不同病原菌菌苔，28 ℃培養(yǎng)5 d，測量抑菌帶寬度，以BMF 03菌株為陽性對照，每種病原菌3次重復(fù)。

在PDA培養(yǎng)基中央接種直徑為5 mm的不同病原菌菌苔，在距培養(yǎng)皿邊緣15 mm處對稱放置4個牛津杯，每個牛津杯注入200 μL無菌發(fā)酵液，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，測量抑菌帶寬度，每種病原菌3次重復(fù)，分別以等量發(fā)酵培養(yǎng)基和BMF 03菌株為陰性及陽性對照。抑菌帶寬度大于5.00 mm判定為有抑菌活性，抑菌帶越大，抑菌活性越好。

1. 4 N-LY-1菌株發(fā)酵液對黃瓜生長的影響及其對黃瓜枯萎病的防治作用

1. 4. 1 含病菌土壤制備 參考暴增海等（2013）的方法制備黃瓜枯萎病接種物，并與土壤按質(zhì)量比1∶80混合均勻，制成含病菌土壤，按每盆1220 g的量裝入規(guī)格為20 cm×32 cm的花盆中，每盆播種15粒黃瓜種子。

1. 4. 2 發(fā)酵液浸種 分別用10、10、10和10 CFU/mL的N-LY-1菌株發(fā)酵液浸泡黃瓜種子24 h，均勻擺放在鋪有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，28 ℃催芽24 h，觀察出芽數(shù)量，計算出芽率;露白后播種至含黃瓜枯萎病菌的土壤中，每個濃度為1個處理，每處理播種3盆為3次重復(fù)，以等體積的無菌水和發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照（CK1和CK2）。

1. 4. 3 發(fā)酵液拌土 將N-LY-1菌株發(fā)酵液與含黃瓜枯萎病菌土壤混合均勻，使土壤中N-LY-1菌株的含菌量為10、10、10和10 CFU/g，播種催芽的黃瓜種子，每個濃度為1個處理，每處理播種3盆為3重復(fù)，以等量的無菌水和發(fā)酵培養(yǎng)基為對照（CK1和CK2）。

1. 4. 4 發(fā)酵液灌根 溫湯浸種催芽后黃瓜種子播種于含黃瓜枯萎病菌的土壤中，黃瓜幼苗長至1葉期分別用10、10、10和10 CFU/mL的N-LY-1菌株發(fā)酵液灌根，每株幼苗5 mL，每隔7 d灌根一次，連續(xù)灌根3次，以等量的無菌水和發(fā)酵液培養(yǎng)基灌根為對照（CK1和CK2）。

1. 4. 5 促生作用及防病效果測定 出苗后35 d，參考王亞楠等（2020）的方法，測定不同處理黃瓜株高、莖粗、干重、鮮重和須根數(shù)，調(diào)查不同處理黃瓜枯萎病的發(fā)病率、病情指數(shù)，計算防治效果。黃瓜枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)參考張素平（2016）的方法。

發(fā)病率（%）=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100

病情指數(shù)= ∑（各級病株數(shù)×對應(yīng)病級）/（調(diào)查 總株數(shù)×最高病級）×100

防治效果（%）= （對照病指-處理病指）/對照 病指×100

1. 5 N-LY-1菌株促生作用機理測定

參考李闖（2017）的方法制備有機磷、無機磷培養(yǎng)基、產(chǎn)IAA檢測培養(yǎng)基、鉻天青（CAS）檢測培養(yǎng)基、產(chǎn)鐵載體定性檢測培養(yǎng)基、固氮培養(yǎng)基和解鉀固體培養(yǎng)基。參考王欣玉（2018）的方法測定菌株解磷解鉀作用、固氮作用、產(chǎn)IAA活性和產(chǎn)鐵載體能力。

1. 6 N-LY-1菌株的種類鑒定

將活化的N-LY-1菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)18 h，觀察菌落大小、形態(tài)及顏色，并進行革蘭氏染色，觀察細(xì)胞形態(tài)及大小;將N-LY-1菌株菌懸液接種至不同的生化管中，按照說明書于不同條件下培養(yǎng)，觀察反應(yīng)管的顯色結(jié)果，將顯色結(jié)果與《結(jié)果詮釋表》比對，確定反應(yīng)結(jié)果。查閱文獻《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（英文版）（Buchanan and Gibbons，1999）及《海洋新菌的分類與鑒定方法》（金光和張曉華，2011）對菌株進行初步鑒定。將菌株送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rDNA序列的PCR擴增和測序，所得序列拼接后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST比對，運用MEGA 7.0中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 N-LY-1菌株對供試植物病原菌的抑制作用

由表1可知，N-LY-1菌株和陽性對照BMF 03菌株及其無菌發(fā)酵液對供試的12種植物病原菌的抑菌帶寬度均大于5.00 mm，均具有明顯的抑菌作用。N-LY-1菌株對蘋果輪紋病菌的抑制作用最強，其菌株和無菌發(fā)酵液的抑菌帶寬度分別為15.90和28.50 mm;其次是對小麥赤霉病菌，其菌株和無菌發(fā)酵液的抑菌帶寬度分別為12.00和27.90 mm。N-LY-1菌株無菌發(fā)酵液對5種病原菌（黃瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、草莓灰霉病菌和月季黑斑?。┑囊志鷰挾雀哂趯φ?其無菌發(fā)酵液對蘋果輪紋病菌、小麥赤霉病菌、草莓灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、番茄早疫病菌和黃瓜枯萎病菌的抑制作用較強，抑菌帶寬度在16.00 mm以上。對照BMF 03菌株的測定結(jié)果與陳茹（2020）的研究結(jié)果一致，說明本試驗結(jié)果可靠。N-LY-1菌株發(fā)酵液對部分病原菌的抑制作用見圖1。

2. 2 N-LY-1菌株發(fā)酵液不同處理對黃瓜生長的影響及其對黃瓜枯萎病的防治效果

2. 2. 1 發(fā)酵液浸種對黃瓜種子發(fā)芽和幼苗生長的影響及其對黃瓜枯萎病的防治效果 發(fā)酵液濃度在10～10 CFU/mL時，黃瓜種子的出芽率、芽長、芽鮮重、芽干重以及株高、莖粗、須根數(shù)、鮮重和干重等指標(biāo)均高于或顯著高于對照（P<0.05），其中，不同濃度N-LY-1菌株發(fā)酵液處理的黃瓜種子出芽率差異不顯著（P>0.05），其他測定指標(biāo)隨發(fā)酵液濃度的升高而增加，發(fā)酵液濃度為10 CFU/mL時各項指標(biāo)最高，其后各項指標(biāo)均有所下降，表明采用N-LY-1菌株發(fā)酵液浸種對黃瓜種子出芽和幼苗生長均具有明顯的促進作用（表2和表3）。

以不同濃度的N-LY-1菌株發(fā)酵液浸種對黃瓜枯萎病具有較高的防治效果，發(fā)酵液濃度10～10 CFU/mL內(nèi)，隨著發(fā)酵液濃度的升高，黃瓜枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)均逐漸降低，防治效果逐漸提高，濃度為10 CFU/mL時防病效果最高，達81.5%，發(fā)酵液濃度升高至10 CFU/mL時防治效果下降為63.0%（表4）。

2. 2. 2 發(fā)酵液拌土對黃瓜幼苗生長的影響及其對黃瓜枯萎病的防治效果 由表5可看出，發(fā)酵液拌土的黃瓜幼苗各項指標(biāo)均高于對照，土壤含菌量10～10 CFU/g時，隨著含菌量的升高，所測指標(biāo)均逐漸提高，含菌量為10 CFU/mL時各項指標(biāo)均最高，含菌量增加至10 CFU/g時各項指標(biāo)均下降。表明采用N-LY-1菌株發(fā)酵液拌土對黃瓜幼苗生長具有明顯的促進作用。

在供試含菌量范圍內(nèi)，黃瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照，土壤含菌量為10～10 CFU/g時，隨著含菌量增加發(fā)病率和病情指數(shù)均逐漸降低，防病效果逐漸提高，土壤含菌量為10 CFU/g時的防治效果最高，達72.2%，土壤含菌量增加至10 CFU/g時防治效果下降為69.1%（表6）。

2. 2. 3 N-LY-1菌株發(fā)酵液灌根對黃瓜幼苗生長的影響及其對黃瓜枯萎病的防治效果 由表7可知，發(fā)酵液灌根的黃瓜幼苗各項指標(biāo)均高于或顯著高于對照，發(fā)酵液濃度在10～10 CFU/mL時，各項指標(biāo)隨著發(fā)酵液濃度的升高而增加，濃度為10 CFU/mL時各項指標(biāo)均最高，此后隨著發(fā)酵液濃度的升高各項指標(biāo)開始下降。

在供試濃度范圍內(nèi)，發(fā)酵液灌根的黃瓜枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于對照，濃度在10～10 CFU/mL時，隨著發(fā)酵液濃度的升高發(fā)病率和病情指數(shù)均逐漸降低，防治效果逐漸提高，濃度為10 CFU/mL時最高，達67.6%，高于10 CFU/mL后防治效果逐漸下降（表8）。

2. 3 N-LY-1菌株對黃瓜生長的促生作用機理

2. 3. 1 固氮、解磷和解鉀作用 N-LY-1菌株和陽性對照BMF 04菌株及SYM-1菌株在固氮培養(yǎng)基上能生成正常菌落，而陰性對照82000菌株未形成菌落，表明N-LY-1菌株具有固氮作用;N-LY-1菌株及陽性對照R-1菌株在解有機磷培養(yǎng)基上能正常生長，并形成暈圈，暈圈直徑與菌落直徑比分別為1.89和2.23 mm，陽性對照SYM-1菌株在解有機磷培養(yǎng)基上能生長，但無透明圈形成，說明菌株N-LY-1具有解有機磷作用;N-LY-1菌株和陽性對照SYM-1菌株在解無機磷培養(yǎng)基和解鉀培養(yǎng)基上均能生長，但均未出現(xiàn)暈圈，說明N-LY-1菌株無解無機磷和解鉀作用（圖2）。試驗結(jié)果表明，固氮和解有機磷作用是N-LY-1菌株促進植物生長的機理之一。

2. 3. 2 產(chǎn)IAA活性 N-LY-1菌株和陰性對照82000菌株在IAA檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，取上清液與Salkowski’s顯色劑暗反應(yīng)20 min，N-LY-1菌株處理變?yōu)榉奂t色，為陽性，陰性對照顏色未發(fā)生變化，說明N-LY-1菌株具有合成IAA的能力。測定不同IAA濃度的OD，建立IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），其回歸方程為y=0.0281x?0.0014，相關(guān)系數(shù)R2為0.9979。

N-LY-1菌株在IAA檢測培養(yǎng)基中培養(yǎng)0～2 d時，隨著時間的延長，IAA濃度逐漸升高，至2 d時IAA濃度達最高值，為2.17 mg/L，其后IAA濃度逐漸下降，至第5 d時IAA濃度僅有0.82 mg/L（圖4）。IAA是植物生長素，一定濃度的IAA能促進植物生長（龔誠君等，2021）。試驗結(jié)果表明，產(chǎn)IAA是N-LY-1菌株的促生機理之一。

2. 3. 3 產(chǎn)鐵載體活性 N-LY-1菌株和陽性對照SYM-1菌株在CAS檢測培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)2 d菌落周圍出現(xiàn)明顯的黃色暈圈，陰性對照82000菌株未能生長，R-1菌株雖能生長但未出現(xiàn)黃色暈圈，說明N-LY-1菌株能產(chǎn)生鐵載體。鐵載體是微生物或植物合成并分泌的一種螯合鐵的用于攝取鐵元素的低分子量化合物，主要存在于微生物中（細(xì)菌和真菌），在胞內(nèi)合成后被分泌到胞外，與環(huán)境中不易被植物吸收的Fe3+結(jié)合，形成穩(wěn)定的鐵復(fù)合物，與植物細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合，將鐵元素運輸?shù)桨麅?nèi)，滿足植物對鐵元素的需求，促進植物生長（張垠等，2011）。試驗結(jié)果表明，產(chǎn)鐵載體是N-LY-1菌株促進植物生長的機理之一。

2. 4 N-LY-1菌株的物種鑒定結(jié)果

N-LY-1菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)18 h，菌落呈灰白色，平滑，濕潤，不透明，邊緣不規(guī)則;菌體球狀，革蘭氏染色為陰性（圖5），與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（Buchanan and Gibbons，1999）和張穎等（2021）及Vandana等（2020）有關(guān)鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）描述的特性基本一致。

生理生化測定結(jié)果（表9）顯示，N-LY-1菌株能使明膠液化，能產(chǎn)過氧化氫酶、還原硝酸鹽和亞硝酸鹽，具有分解葡萄糖、阿拉伯糖和麥芽糖的能力，尿素酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸和吲哚試驗等為陰性，與Denner等（2001）報道的Sphingomonas sp. Nov.測定結(jié)果基本一致。

將N-LY-1菌株的16S rDNA序列與NCBI中同源序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與海膽鞘氨醇單胞菌（S. echinoides）（登錄號為MG745876.1）的序列相似性為99%。選取同屬內(nèi)相似性較高的不同菌株及親緣關(guān)系較遠菌株的16S rDNA序列，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。由圖6可知，N-LY-1菌株與海膽鞘氨醇單胞菌位于同一分支，親緣關(guān)系最近。

結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將N-LY-1菌株鑒定為海膽鞘氨醇單胞菌。

3 討論

植物促生細(xì)菌的促生機制復(fù)雜多樣，目前報道的細(xì)菌促生機理主要包括：通過解有機及無機磷、解鉀、固氮和產(chǎn)鐵載體作用，有效分解土壤中難溶和固定的元素，為植物提供可利用的營養(yǎng)元素;其次是合成促進植物生長的物質(zhì)，如產(chǎn)IAA等植物激素，絕大多數(shù)促生細(xì)菌能合成IAA，促進植物生長（宋維民等，2020）。不同細(xì)菌的促生作用機制不同，葉維雁等（2017）、劉娜（2020）、李福艷等（2021）、張軍等（2021）從土壤中分離得到能促進油菜、玉米等植物生長的JDYB1、PSYB、PK-1、PK-2和TS4等不同細(xì)菌菌株，不僅具有固氮、解磷、解鉀作用及產(chǎn)IAA、鐵載體能力，還能防治灰霉?。˙otrytis cinerea）和枯萎病等;劉春菊等（2020）從煙草根系分離到的新洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）可產(chǎn)生IAA，具有較好的溶磷效果，能促進煙草生長;楊豆等（2020）從竹科植物根系分離獲得16株細(xì)菌，其中2株細(xì)菌具有解磷和產(chǎn)IAA能力，對毛竹生長具有促進作用;孟建宇等（2021）從內(nèi)蒙古灌木根際分離得到能促進荒漠灌木生長的細(xì)菌SP0412和0403等，具有解磷能力并能產(chǎn)鐵載體;謝光杰等（2021）從甘蔗根系分離得到對甘蔗具有促生長特性的68株細(xì)菌，其中7株菌株有促生長特性，能產(chǎn)IAA和ACC脫氨酶。鞘氨醇單胞菌廣泛分布于海水、河水、地下水和地下沉積物，有學(xué)者研究表明鞘氨醇單胞菌具有解磷、耐鎘能力，可分泌IAA，促進植物生長（潘彥碩等，2018;張苗等，2020;甄靜等，2020）;王志剛等（2015）研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌CL01對西瓜幼苗根莖生長具有促進作用，具有高效解磷能力;李興杰（2019）從土壤中分離得到1株促進油菜生長的鞘氨醇單胞菌CX-15，具有耐鎘特性，可輔助超富集植物修復(fù)鎘污染土壤，并能產(chǎn)IAA。本研究結(jié)果表明，海膽鞘氨醇單胞菌N-LY-1菌株具有固氮和解有機磷作用，能產(chǎn)生IAA，與前人研究結(jié)果基本一致，而該菌株還能產(chǎn)生鐵載體、促進黃瓜生長、并對黃瓜枯萎病具有明顯的防治作用等國內(nèi)尚未見報道。

4 結(jié)論

海膽鞘氨醇單胞菌N-LY-1菌株及其無菌發(fā)酵液對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用，采用N-LY-1菌株發(fā)酵液浸種、拌土和灌根處理對黃瓜幼苗的生長具有明顯的促進作用，且對黃瓜枯萎病具有良好的防治效果;固氮、解有機磷作用及產(chǎn)生IAA和鐵載體是該菌株的促生作用機制。N-LY-1菌株具有進一步開發(fā)為農(nóng)用微生物制劑的潛力。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）