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        有機與非有機荷斯坦牛乳脂肪酸指紋聚類分析

        2022-06-14 08:21:30賈佳張鑫郭軍
        食品研究與開發(fā) 2022年10期
        關鍵詞:乳企牧場指紋

        賈佳,張鑫,郭軍

        (內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古 呼和浩特 010018)

        有機飼養(yǎng)不僅是無人工化學合成物質投入的概念,也意味著更好的飼養(yǎng)條件和動物福利[1]。Scozzafava等[2]調研發(fā)現提供有關有機農業(yè)倫理信息,如動物福利和環(huán)境可持續(xù)性,可以促進消費者的購買意愿。然而有機乳價格較高,且缺乏統(tǒng)一的營養(yǎng)品質標準,因此對有機乳的鑒別顯得尤為重要。Samarra等[3]提出通過氧脂素作為有機牛乳評估的生物標志物來區(qū)分有機和非有機乳。Liu等[4]報道便攜式近紅外光譜能夠區(qū)分有機牛乳和普通牛乳。張鑫[5]根據主成分分析觀察的自然聚類效果,推測利用脂肪酸指紋鑒別有機和非有機乳具有一定的可行性,但未建立驗證判別模型。Chung等[6]研究發(fā)現測量碳氮同位素可能有助于確定有機乳的真實性。相關研究表明乳脂肪酸的含量和構成與家畜飼養(yǎng)模式密切相關[7-9]。Liu等[10]研究發(fā)現牛乳與飼草中脂肪酸存在特定的關系。白薩如拉[11]研究發(fā)現奶牛膳食中添加苜蓿和青貯可提高乳中C18∶2n6和α-C18∶3n3含量。楊炳壯等[12]研究發(fā)現日糧添加占精料2%的花生油會使牛乳中共軛亞油酸的含量提高。Bork等[13]發(fā)現飼料加入亞麻籽后牛乳α-C18∶3n3含量顯著升高。

        綜上研究,對不同飼養(yǎng)模式下生產的乳及其相關食品營養(yǎng)和品質研究多使用傳統(tǒng)的統(tǒng)計學手段,近十年食品特征研究評價和真實性判別中越來越多地引入聚類分析、分類分析、模式分析和判別分析等化學計量學原理和軟件技術[14-15]。主成分分析(principal component analysis,PCA)雖然不是專門的聚類分析方法,但因PCA可以將每一個研究對象(即樣本)以某一類營養(yǎng)素組或理化指標集投射到二維或三維空間的一個點,因此屬于無監(jiān)督的自然聚類觀察方法,是直觀觀察樣本集自然聚類或離散分布的理想策略和工具。而軟獨立建模分類(soft independent modeling of class analogies,SIMCA)是建立在PCA基礎上專門的有監(jiān)督的聚類和分類分析方法,目前在食品研究和應用領域使用比較廣泛[16-18]。

        目前國內關于有機與非有機乳,尤其是市售有機超高溫滅菌(ultra-high temperature,UHT)乳脂肪酸(fatty acids,FAs)特征研究較少。本研究旨在系統(tǒng)地檢測和比較國內大型乳品企業(yè)有機和普通(非有機)乳的FAs含量和比值,獲得參考價值較高的有機和非有機乳FAs參數,而最根本的目標是觀察有機乳和非有機乳以FAs指紋聚類的特征,以及企業(yè)品牌間的差異,并論證和嘗試以FAs指紋建立模型判別市售有機和非有機UHT乳的可行性。

        1 材料與方法

        1.1 樣品

        采集荷斯坦牛乳樣品共94份。原乳包括A和C兩個乳品企業(yè)(簡稱乳企A、乳企C),乳企A牧場原乳共30份,其中有機牧場20份,非有機牧場10份,采樣地為錫林郭勒盟和呼和浩特市周邊;乳企C牧場原乳共29份,其中有機牧場14份,非有機牧場15份,采樣地為巴彥卓爾盟和阿拉善,采樣時間均為七月至十月的夏秋季節(jié)。荷斯坦牛UHT液態(tài)乳包括A、B和C 3個品牌。其中3個品牌有機UHT乳共15份,A和B兩個品牌非有機UHT乳共20份,均為市售。本次采樣沒有涉及乳企B有機和非有機原乳及C品牌非有機UHT乳。原乳樣品現場液氮迅速降溫,-18℃冷凍保藏運輸;UHT液態(tài)乳樣品室溫(16℃)存放。

        1.2 試劑

        甲醇(色譜純):北京邁瑞達科技有限公司;正庚烷、三氟化硼甲醇(色譜純):上海麥克林生化科技有限公司;十一碳酸甘油三酯標準品、37組分脂肪酸甲酯混合標準品:美國Sigma公司。

        1.3 儀器設備

        FL-9720型氣相色譜儀、氫火焰離子檢測器(hydrogen flame ionization detector,FID):浙江福立分析儀器有限公司;T18均質機、旋轉蒸發(fā)儀RV8:德國IKA公司。

        1.4 檢測方法

        參照GB 5009.168—2016《食品安全國家標準食品中脂肪酸的測定》[19]中堿水解提取法對乳樣脂肪酸進行測定,每個樣品做兩個平行。色譜條件:毛細管柱型號為 SP-2560(100 m×0.25 mm,0.20 μm);使用程序升溫:初始溫度100℃,保持5 min,以4℃/min升溫至240℃,保持30 min;進樣口溫度260℃;檢測器溫度260 ℃;載氣:高純氮氣;分流式進樣:分流比 20∶1;進樣體積:1.0 μL。FL9720氣相色譜工作站分析FAs色譜圖,內標法計算脂肪酸含量。

        1.5 統(tǒng)計分析

        使用化學計量學軟件Pirouette 4.5進行PCA分析,進行數據降維和無監(jiān)督的聚類分析,觀察有機和非有機牛乳FAs指紋的自然聚類特征,再結合描述性統(tǒng)計評價有機和非有機乳,以及不同乳企有機和非有機乳FAs的整體差異。建立SIMCA判別模型進一步論證以FAs指紋判別有機乳和非有機乳的可行性,并評價了SIMCA模型的判別準確率。利用IBM-SPSS 23.0對FAs數據進行描述性統(tǒng)計比較,結果以平均值±標準差表示;每一種FAs的差異進行獨立樣本t檢驗,FAs的整體差異進行配對t檢驗。不同企業(yè)/品牌有機乳對非有機乳FAs的差異比值用“有機乳脂肪酸/非有機乳脂肪酸”表示,脂肪酸比值1.0以上為增加,1.0以下為減少。

        2 結果與分析

        全部有機和非有機乳FAs指紋PCA分析中有分離趨勢,但二者交叉和膠著部分較多。鑒于熱穩(wěn)定試驗中原乳和UHT乳指紋有分離,因此對有機與非有機原乳、有機與非有機UHT乳分別進行研究。

        2.1 有機與非有機牧場原乳FAs指紋特征

        乳企A和乳企C兩個有機與非有機牧場原乳FAs指紋PCA結果見圖1~圖3。乳企A和乳企C有機與非有機原乳FAs描述性統(tǒng)計結果見表1。

        圖1 乳企A和乳企C有機與非有機牧場原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.1 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A and C dairy

        圖2 乳企A有機與非有機牧場原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.2 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of A dairy

        圖3 乳企C有機與非有機牧場原乳FAs指紋PCA分析圖Fig.3 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic raw milk of C dairy

        表1 有機與非有機原乳FAs描述性統(tǒng)計結果Table 1 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic raw milk g/100 g

        PCA得分向量圖(圖1a)顯示原乳按有機和非有機飼養(yǎng)模式分開聚類,兩個乳企有機乳分布在圖中左右兩邊,非有機乳集中分布在中間位置,說明有機與非有機牧場原乳的FAs指紋存在差異;圖2a和圖3a顯示兩個乳企有機和非有機牧場原乳在三維空間聚類位置缺乏一致性,說明兩個企業(yè)奶牛飼養(yǎng)模式標準及飼料配比等都存在較大差異。

        由表1可知,兩個乳企有機與非有機牧場乳原乳中大部分FAs獨立樣本t檢驗差異顯著(P<0.05),少數 FAs差異不顯著(P>0.05);但整體上 FAs配對 t檢驗無顯著差異(P>0.05),說明傳統(tǒng)差異檢驗不能區(qū)分有機與非有機牧場原乳FAs復雜的整體差異。

        由圖1b、圖2b和圖3b結合描述統(tǒng)計(表1)可知,對有機和非有機牧場原乳分離貢獻大的特征FAs有PUFA、n-3PUFA(α-C18∶3n3)、n-6PUFA(C18∶2n6c)以及 C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c 等,其中 n-3PUFA(α-C18∶3n3)在兩個乳企有機乳中含量均較高。兩個乳企的特征FAs含量比值(有機乳脂肪酸/非有機乳脂肪酸)不同,說明不同企業(yè)有機飼料、飼養(yǎng)標準和動物福利等因素可能不同[20-21]。

        2.2 有機與非有機UHT乳FAs指紋特征

        3個品牌有機與非有機UHT乳FAs指紋PCA結果見圖4、圖5和圖6,FAs描述性統(tǒng)計結果見表2。

        圖4 3個品牌有機與非有機UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.4 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of three brands

        圖5 品牌A有機與非有機UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.5 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of A brand

        圖6 品牌B有機與非有機UHT乳FAs指紋PCA分析圖Fig.6 PCA on FAs fingerprint of organic and non-organic UHT milk of B brand

        圖4a顯示UHT乳按有機與非有機分開聚類趨勢明顯,有機乳聚類在分割線左側,非有機乳聚類在分割線右側;A和C品牌有機與非有機聚類明顯分離,但B品牌有機與非有機有所交叉,說明有機與非有機UHT乳的FAs指紋不同,提示以有機和非有機UHT乳建??尚?,但建模時需要分析剔除可能不嚴格的有機產品;A與B和C兩個品牌有機UHT乳有明顯的分離,但B和C品牌聚類較近,并有部分交叉,說明不同品牌有機UHT乳FAs指紋不同,即有機飼養(yǎng)模式或標準有差異。B和C有交叉,說明兩個品牌乳源相近。總之不同企業(yè)品牌UHT乳FAs指紋有差異,可以作為UHT乳品牌鑒別的方法。圖5a和圖6a顯示單一品牌有機和非有機UHT乳完全分開聚類,再次證明有機和非有機UHT乳可以鑒別;兩個品牌UHT乳有機和非有機聚類基本都是左右分開聚類,分離位置和趨勢有一致,這可能與UHT乳生產使用大罐多牧場混合原奶及標準化工藝有關,但也再次證明有機和非有機UHT乳的鑒別會比較穩(wěn)健。

        表2 有機與非有機UHT乳FAs描述性統(tǒng)計結果Table 2 Descriptive statistics on FAs of organic and non-organic UHT milk g/100 g

        由表2可知,兩個品牌有機與非有機UHT乳多數FAs差異顯著(P<0.05),少數FAs差異不顯著(P>0.05),但整體上FAs配對樣本t檢驗無顯著差異(P>0.05),說明傳統(tǒng)檢驗不能區(qū)分有機與非有機UHT乳FAs構成的整體差異。

        由圖4b、圖5b和圖6b結合描述統(tǒng)計(表2)可知,形成有機與非有機UHT乳分離的特征FAs,C18∶2n6c和α-C18∶3n3含量在有機UHT乳中顯著高于非有機UHT 乳;C16∶0 和C16∶1 含量在非有機 UHT 乳中顯著高于有機UHT乳。復合指標中PUFA、n-3系PUFA、n-6系PUFA含量在有機UHT乳中顯著高于非有機UHT乳。3個品牌有機UHT乳中關鍵FAs含量有較大差別,如A、B和C品牌有機UHT乳中α-C18∶3n3含量比值為 1∶0.7∶0.8;A 品牌有機 UHT 乳中 α-C18∶3n3和C18∶2n6c相對于非有機乳的比值高于B品牌,這可能是因為不同企業(yè)飼養(yǎng)模式標準的差異。

        2.3 有機與非有機UHT乳SIMCA模型的建立及判別

        為進一步論證以FAs指紋鑒別市售有機和非有機UHT乳的可行性,建立和評價基于在PCA分析基礎上發(fā)展起來的SIMCA判別模型,結果見圖7。

        圖7 有機與非有機UHT乳FAs指紋SIMCA模型Fig.7 SIMCA model for organic and non-organic UHT milk by FAs fingerprint

        圖7顯示,有機與非有機UHT乳聚類云有明顯分離,有機UHT乳的云圖分布在三維圖左上方,非有機UHT乳的云圖分布在三維圖右下方,與PCA分析結果一致。

        SIMCA模型內部驗證和外部驗證的樣本集及結果見表3。

        表3 SIMCA驗證內部和外部模型Table 3 Internal and external verification on SIMCA model

        由表3可知,內部驗證,用35份乳樣平行測定結果建立的模型逐一對每個樣品判別,判斷正確率為100%;外部驗證,每次人工隨機抽出2~7套樣本FAs數據組,用其余樣本數據組建模,對抽出的樣本數據進行判別;這種隨機組合建模驗證重復20次,累計84個驗證樣本量,判別正確率為90.5%,其中B品牌非有機UHT乳判別錯誤次數較多,再次說明不同企業(yè)飼養(yǎng)模式標準不同??紤]本次建模訓練樣本集數量較小,但已達到較為理想的判別正確率,若后續(xù)擴大樣本量,調整模型參與判別的因子數量并對SIMCA模型進行反復的“訓練”,可建立更穩(wěn)健的模型,達到更準確的判別結果。

        本次建模選取含量0.5 g/100 g乳脂肪以上的16種FAs,每一種FAs對建立SIMCA模型的貢獻率見圖8。

        圖8 各種脂肪酸對SIMCA模型建立的貢獻率Fig.8 Contribution percentage of various FAs to the SIMCA model

        由圖8可知,造成有機和非有機UHT乳差異的主要 FAs中C14∶0、C16∶0、C18∶0 和 C18∶1n9c對 SIMCA 模型建立的貢獻率均高于80%,且本次參與建模的16種FAs中12種FAs的貢獻率均高于50%,說明這幾種FAs均為構建SIMCA模型的重要指標。

        3 討論

        有機飼養(yǎng)不僅意味著更好的動物福利和更優(yōu)良的飼養(yǎng)條件,還意味著食品更安全和更營養(yǎng)。研究表明不同飼養(yǎng)模式對乳FAs有決定或影響的作用,不同飼養(yǎng)模式乳FAs差異主要與飼料組成及配比的不同有關[7-9]。本研究PCA結果顯示,有機和非有機乳以FAs指紋各自聚類;不同企業(yè)有機與非有機牧場原乳聚類位置缺乏一致性,不同企業(yè)有機和非有機UHT乳分開聚類的位置和趨勢存在一致性。原乳聚類位置缺乏一致性的可能的原因是不同企業(yè)有機標準、日糧組成及動物福利等狀況和待遇不同;而UHT乳聚類位置和趨勢的一致性可能與UHT乳生產中使用大罐多牧場混合原奶以及標準化等工藝有關。另外不同企業(yè)關鍵乳FAs含量比值(有機乳FAs/非有機乳FAs)的不同,同樣也可以對飼養(yǎng)的效果及科學性進行評價。

        化學計量學多變量分析策略、原理及方法是解析多指標內外變化規(guī)律和模式的理想工具,PCA是一種最常用的化學計量學方法,普遍用于多指標數據集結構和內在數據結構或模式的解析,可對樣品進行無監(jiān)督的聚類、分類和模式分析[22-25],可以直觀觀測多個樣本在二維或三維空間的聚類或離散分布狀況,并觀察樣本所歸屬的簇/群,通過觀察載荷圖可以找出對分類貢獻大的因素。傳統(tǒng)統(tǒng)計結果中多數FAs在有機與非有機乳間存在顯著或極顯著差異,但單指標的孤立分析不足以證明不同飼養(yǎng)模式會產生特征性作用,即傳統(tǒng)統(tǒng)計和差異檢驗對多變量分析能力存在缺陷[14-15],因此需要結合化學計量學對乳FAs復雜的變化模式進行區(qū)分?;瘜W計量學分析手段與傳統(tǒng)描述性統(tǒng)計相輔相成,為評價有機乳制品真實性鑒別方面提供了創(chuàng)新的策略、原理和方法。

        食品完整性和真實性不僅關系消費者健康、權益和尊嚴,而且關乎市場競爭秩序和行業(yè)的健康發(fā)展。近年來判別分析已逐步應用于食品真實性研究方面,如對乳制品和肉類的研究。本研究構建有機與非有機UHT乳SIMCA模型,平行測定數據一并納入聚類分析,提高了模型的穩(wěn)健度。乳樣的聚類符合有機與非有機分類,結果與PCA一致。內部和外部驗證準確率分別為100%和90.5%,證明利用FAs指紋建立有機與非有機UHT乳真實性判別模型具有可行性。外部驗證錯誤主要出現在B品牌非有機UHT乳判別中,可能是因為不同品牌飼養(yǎng)模式或飼料等標準有差異。當然還應繼續(xù)加大其他符合有機飼養(yǎng)條件的有機乳產品,進行驗證和優(yōu)化,以增強模型判別的穩(wěn)健性。

        4 結論

        PCA分析可實現有機和非有機乳FAs差異的可視化觀察,乳樣可以根據有機和非有機自然聚類,但有機和非有機乳差異的全面評價也不能忽略描述性統(tǒng)計。不同企業(yè)有機和非有機乳之間關鍵FAs的比值不同,不同企業(yè)奶牛的有機飼養(yǎng)模式或標準存在差異。FAs指紋建模判別有機與非有機UHT乳可行,可獲得較高的判別準確率。

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