鄧 亮,趙曉琴,張艷霞,王自潤(rùn),柴茂山

(1.山西大同大學(xué),山西 大同 037009;2.山西省大同市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,山西 大同 037009)

經(jīng)方中半夏的炮制方法為“湯洗”,其具體操作為“用熱水反復(fù)將生半夏(鮮半夏)表面的毒性涎滑物質(zhì)清洗干凈”[1]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此炮制方法的合理性,本課題擬通過在實(shí)驗(yàn)室對(duì)用經(jīng)方中半夏炮制方法制出的“古法制半夏”與現(xiàn)代?中華人民共和國(guó)藥典?(簡(jiǎn)稱?中國(guó)藥典?)炮制方法制出的等量法半夏、姜半夏、清半夏進(jìn)行有效成分測(cè)量,并比較分析,以衡量經(jīng)方中半夏炮制方法是否合理。

2015版?中國(guó)藥典?中半夏的含量控制指標(biāo)是酸堿滴定法檢測(cè)總有機(jī)酸中琥珀酸的含量,而總有機(jī)酸以琥珀酸為主,琥珀酸是半夏的非專屬性成分,規(guī)定不低于0.25%,但半夏硫熏后總有機(jī)酸含量會(huì)升高,所以2020版?中國(guó)藥典?中刪除了半夏總有機(jī)酸中琥珀酸的含量測(cè)定[2]。目前,現(xiàn)行?中國(guó)藥典?中無半夏的質(zhì)量控制指標(biāo),缺少專屬性的質(zhì)量控制方法。半夏作為一種常用的中藥,其化學(xué)成分豐富,藥理作用廣泛,對(duì)半夏的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步研究,可為探討半夏的藥理作用和安全用藥奠定基礎(chǔ)。有文獻(xiàn)報(bào)道,半夏主要含有機(jī)酸、生物堿、核苷類、蛋白質(zhì)、多糖等,目前報(bào)道的與藥效相關(guān)的成分主要有生物堿、有機(jī)酸和核苷類,并采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定不同產(chǎn)地半夏藥材中尿苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸和鹽酸麻黃堿5個(gè)代表性有效成分的含量[3]。本項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同加工方式中有效成分的含量差異較大,不能有效控制半夏的質(zhì)量。因此,本實(shí)驗(yàn)將采用分離效能和靈敏度較高的HPLC測(cè)定古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中鳥苷成分的含量,并對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證,且應(yīng)用于各半夏炮制品的質(zhì)量評(píng)價(jià)中,同時(shí)對(duì)古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中的鳥苷、腺苷、尿苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、琥珀酸等有效成分進(jìn)行定性分析,建立其特征圖譜質(zhì)量表征方法,為半夏炮制品的質(zhì)量表征與控制提供方法支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫LC 1260Ⅱ高效液相色譜儀,Shim-Pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,MS105DU電子分析天平(瑞士梅特勒),Practum224-1CN電子分析天平(德國(guó)賽多利斯),鼎泰雙頻超聲儀,TG16-WS高速離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.2 試劑 甲醇為色譜純,對(duì)照品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院,鳥苷對(duì)照品批號(hào)為111977-201501,含量為93.6%;腺苷對(duì)照品批號(hào)為110879-200202;尿苷對(duì)照品批號(hào)為110887-200202;鹽酸麻黃堿對(duì)照品批號(hào)為171241-201007,含量為99.7%;鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品批號(hào)為171237-201003;琥珀酸對(duì)照品批號(hào)為110896-201602,供鑒別用。

1.3 藥材飲片樣品 研究用樣品包括古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏各兩批;生半夏藥材產(chǎn)地為山西夏縣,古法制半夏采用?傷寒雜病論?中半夏的炮制方法“湯洗”炮制而成;法半夏、姜半夏、清半夏均從市場(chǎng)購買。各樣品均經(jīng)大同市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心鑒定,來源為天南星科植物半夏的干燥塊莖。具體炮制方法如下,古法制半夏:取生半夏,趁鮮去皮,用熱水淘洗數(shù)次,至半夏表面的涎滑物質(zhì)清洗干凈,烘干即得。法半夏、姜半夏、清半夏均按照2020版?中國(guó)藥典?中方法炮制[2]。

2 方法

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱:島津shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇為流動(dòng)相A,以水為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫(0～3 min,3%A;3～20 min,3%～10%A;20～40 min,10%～70%A;40～50 min,70%A);流速為每分鐘0.8 m L;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;進(jìn)樣量為10μL;柱溫為30℃。理論塔板數(shù)不應(yīng)低于5 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鳥苷對(duì)照品11.05 mg、腺苷對(duì)照品10.25 mg、尿苷對(duì)照品10.76 mg,分別置于25 m L容量瓶中,加5%甲醇至25 m L,搖勻,再精密量取1 m L放入20 m L容量瓶中,加5%甲醇至20 m L,搖勻,制成含20.69μg/m L鳥苷溶液,作為對(duì)照品溶液。

精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品10.34 mg、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品10.66 mg,琥珀酸對(duì)照品10.66 mg,分別置100 m L容量瓶中,加5%甲醇至100 m L,搖勻,制成含103.4μg/m L鹽酸麻黃堿溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本實(shí)驗(yàn)樣品粉末(過4號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置于100 m L具塞錐形瓶中,精密加水20 m L,密塞,稱定重量,煎煮30 min,放冷,過濾,用水補(bǔ)足減失的重量,搖勻,離心(5 000 r/min)10 min,傾取上清液,過濾,續(xù)取濾液,過微孔濾膜(0.45μm),即得。

2.4 方法學(xué)考察(以鳥苷含量進(jìn)行驗(yàn)證)

(1)線性范圍考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下的鳥苷對(duì)照品溶液(20.69μg/m L),用5%甲醇逐級(jí)稀釋,得到不同質(zhì)量濃度的鳥苷對(duì)照品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣分析,回歸方程為Y＝3 816.7X－0.323 2,R＝0.999 9,結(jié)果表明鳥苷在0.041 38～0.413 80μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

(2)精密度實(shí)驗(yàn) 吸取鳥苷對(duì)照品溶液(20.69μg/m L),連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量為10μL,在上述色譜條件下測(cè)定鳥苷峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.28%,結(jié)果表明精密度實(shí)驗(yàn)符合有關(guān)規(guī)定。

(3)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在室溫條件下,取同一供試品(古法制半夏),按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下樣品測(cè)定方法制備的溶液,分別在放置0、2、4、8、16、24 h后進(jìn)樣,進(jìn)樣量為10μL,測(cè)定鳥苷峰面積,計(jì)算RSD為0.98%,結(jié)果表明鳥苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(4)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品(古法制半夏)樣品,取樣6份,按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下樣品測(cè)定方法制備測(cè)定,進(jìn)樣量為10μL,做平行實(shí)驗(yàn),每份進(jìn)樣2次,記錄鳥苷峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算,鳥苷含量平均值為0.102 5 mg/g,RSD為0.90%,結(jié)果表明重復(fù)性實(shí)驗(yàn)符合有關(guān)規(guī)定。

(5)加樣回收率實(shí)驗(yàn)(采用加樣回收法) 精密稱取重復(fù)性考察測(cè)定后已知含量的供試品(古法制半夏)樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下樣品測(cè)定方法減半取量,每份約0.75 g,共稱取6份,分別置于100 m L具塞錐形瓶中,再分別精密加入鳥苷對(duì)照品溶液(20.69μg/m L)5 m L,按“2.3”項(xiàng)下方法制備,并按以上色譜條件測(cè)定,記錄鳥苷峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算回收率,結(jié)果鳥苷平均回收率為102.0%,RSD為1.13%,結(jié)果表明加樣回收率實(shí)驗(yàn)符合有關(guān)規(guī)定,見表1。

表1 鳥苷回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5 兩個(gè)批次半夏炮制品樣品鳥苷含量測(cè)定 對(duì)半夏兩個(gè)批次的4種不同炮制方法炮制的半夏炮制品樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下制備樣品,按“2.1”色譜條件進(jìn)樣,經(jīng)HPLC測(cè)定各樣品中鳥苷含量,結(jié)果見表2。

表2 兩個(gè)批次樣品鳥苷含量測(cè)定結(jié)果

2.6 特征峰測(cè)定 取各樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項(xiàng)下制備樣品,按“2.1”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.7 特征峰指認(rèn) 標(biāo)記了10個(gè)含量較高且色譜分離效果穩(wěn)定的色譜峰(琥珀酸成分的特征不包含在此特征圖譜中),特征峰采用鳥苷對(duì)照品標(biāo)記其特征峰,鳥苷對(duì)照品溶液色譜圖見圖1,腺苷對(duì)照品溶液色譜圖見圖2,尿苷對(duì)照品溶液色譜圖見圖3,鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液色譜圖見圖4,鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品溶液色譜圖見圖5,琥珀酸對(duì)照品溶液色譜圖見圖6。(掃描題目右側(cè)二維碼查看圖片。)

2.8 半夏炮制品特征圖譜結(jié)果 各樣品特征圖譜見圖7—10。(掃描題目右側(cè)二維碼查看圖片。)記錄各峰保留時(shí)間,確認(rèn)保留時(shí)間范圍,通過各峰面積值比較,以鳥苷色譜峰(峰5)為參比峰(s)比較各色譜峰相對(duì)峰面積情況,見表3。

表3 各樣品特征圖譜峰面積測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 鳥苷含量測(cè)定 古法制半夏平均含量為0.112 5 mg/g,法半夏為0.091 2 mg/g,姜半夏為0.190 5 mg/g,清半夏為0.015 1 mg/g,見表2。

3.2 特征圖譜表征

(1)從圖譜可以看出,經(jīng)過石灰、白礬炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中各成分有所損失,法半夏、姜半夏缺失第3、6、8號(hào)峰;清半夏中鳥苷大大減少。古法制半夏各個(gè)峰均較顯著,成分損失小,說明古法制半夏的炮制方法對(duì)半夏的有效成分保留較多,而且避免石灰、白礬等對(duì)人體的毒副作用。

(2)在鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿成分的檢測(cè)中對(duì)照品有檢出,但各半夏炮制品樣品中均未見鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿色譜峰,可能與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿不易溶于水且不適合此檢測(cè)方法有關(guān)。

(3)可能由于琥珀酸含量低,在檢測(cè)時(shí),其對(duì)照品分別在41.758、43.725、50.000出現(xiàn)了3個(gè)峰(見圖6,掃描題目右側(cè)二維碼查看),主峰在41.758;樣品檢測(cè)中制半夏、法半夏、清半夏、姜半夏均未檢出琥珀酸成分。分析原因在于半夏總有機(jī)酸中琥珀酸含量太低,琥珀酸成分的特征也不包含在上述特征圖譜中。

4 討論

半夏在臨床上廣泛運(yùn)用于風(fēng)寒濕痰、胃反嘔吐、瘰疬、腫瘤等病證的治療,但因其有毒,臨床上對(duì)其應(yīng)用須炮制后使用(如法半夏、姜半夏、清半夏等),且用量較小。對(duì)于此用法,近代名醫(yī)姜春華認(rèn)為現(xiàn)代半夏制法均“使半夏失卻藥性,成為淡而無味有名無實(shí)的藥渣”[4]。山西名老中醫(yī)李可教授認(rèn)為現(xiàn)代制半夏藥效較差”[5]。

本課題通過對(duì)用經(jīng)方中半夏炮制方法制出的古法制半夏與用現(xiàn)代?中國(guó)藥典?中半夏炮制方法制出的法半夏、姜半夏、清半夏進(jìn)行有效成分測(cè)量及比較分析,以衡量經(jīng)方中半夏的炮制方法對(duì)于藥物有效成分的保留是否更為合理。

4.1 鳥苷含量分析 古法制半夏生品來源于山西夏縣,自行加工炮制;法半夏、姜半夏、清半夏均從市場(chǎng)購買。由于本課題資金有限,藥材質(zhì)量層次不一,故可能導(dǎo)致檢測(cè)用樣品的鳥苷成分含量也不一致,僅憑一種鳥苷成分也不能全面反映半夏各炮制品的內(nèi)外質(zhì)量。為了準(zhǔn)確反映各炮制品之間的質(zhì)量差異,本課題組采用HPLC-UV色譜法建立了半夏炮制品特征圖譜表征方法,在已建立的鳥苷含量測(cè)定的同時(shí),測(cè)定尿苷、腺苷等10個(gè)特征峰圖譜。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過石灰、白礬炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中的10個(gè)特征峰缺失了第3、6、8號(hào)峰;清半夏中鳥苷含量大大減少,其他特征峰也比古法制半夏小;古法制半夏各個(gè)峰均較顯著,成分損失小,古法制半夏的炮制方法對(duì)半夏的有效成分保留較多,說明經(jīng)方中半夏的炮制方法對(duì)于藥物有效成分的保留是合理的。此法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,為半夏炮制品的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了研究基礎(chǔ)。

4.2 特征圖譜分析 中藥化學(xué)成分復(fù)雜多樣,不同成分協(xié)同發(fā)揮藥效作用。在質(zhì)量指標(biāo)成分不明確時(shí),相關(guān)文獻(xiàn)也僅限于對(duì)某一種或某幾種指標(biāo)成分進(jìn)行定量測(cè)定,因此本實(shí)驗(yàn)在采用鳥苷含量測(cè)定的基礎(chǔ)上,以鳥苷作為質(zhì)量標(biāo)志物,對(duì)半夏中核苷類成分采用HPLC,對(duì)不同方法炮制的半夏炮制品中水溶性成分進(jìn)行色譜峰特征定位表征,同時(shí)確定了腺苷、尿苷的特征峰,這樣可解決中藥對(duì)照品不易獲得且對(duì)多成分含量測(cè)定造成局限性的難題,從10個(gè)特征色譜峰的保留時(shí)間、數(shù)量、位置、大小以評(píng)判半夏各炮制品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣,從而得出古法制半夏的成分損失最少。

綜合上述水溶性小分子成分的實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果分析,經(jīng)方中半夏的炮制方法“湯洗”對(duì)于半夏有效成分的保留要優(yōu)于現(xiàn)代法半夏、姜半夏、清半夏的炮制方法,故建議增加古法制半夏的藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這種定量與定性相結(jié)合的HPLC特征圖譜表征測(cè)量方法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,為半夏炮制品的質(zhì)量控制提供了方法支持,有利于半夏在治療中發(fā)揮更好的作用。由于本課題基金有限,實(shí)驗(yàn)測(cè)量中存在樣本數(shù)量少的不足,檢測(cè)結(jié)果有待進(jìn)一步完善與提高,希望能為臨床更合理、有效地使用半夏提供參考依據(jù)。