趙曉野，梁瓊*，王婷，王儒

海南省食品藥品檢驗(yàn)所海口分所（?？?570311）

眾所周知，貝類毒素在貝類體內(nèi)的積累是由于貝類的生活習(xí)性決定的，由于貝類無(wú)法自由移動(dòng)，只能濾食其生活環(huán)境周圍的海藻，近年來(lái)，由于海洋環(huán)境污染日益嚴(yán)重，赤潮爆發(fā)次數(shù)逐漸增多[1-2]，赤潮爆發(fā)時(shí)，貝類會(huì)大量濾食含有毒素的海藻，由于貝類自身對(duì)毒素不敏感[3]，造成毒素在其體內(nèi)大量積累[4-5]，人類食用含有毒素的貝類產(chǎn)品時(shí)就會(huì)造成中毒現(xiàn)象。我國(guó)海岸線較長(zhǎng)，海岸及底質(zhì)類型多樣，灘涂面積較大，貝類資源十分豐富，貝類也成了人們?nèi)粘２妥里嬍车闹匾M成部分。但是，近年來(lái)時(shí)有食用貝類中毒的事件報(bào)道，給人們帶來(lái)一定的恐慌。為保障消費(fèi)者的食用安全，我國(guó)對(duì)貝類水產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格管理和風(fēng)險(xiǎn)控制，并制定了貝類水產(chǎn)品及其制品的PSP限量標(biāo)準(zhǔn)。GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，貝類中的PSP最高限量為4 MU/g，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、國(guó)際海洋學(xué)委員會(huì)、世界衛(wèi)生組織及歐盟對(duì)PSTs最高限量值為800 STXeq μg/kg[6-7]，即每100 g貝類軟組織中PSP毒性的STX當(dāng)量值不得高于80 μg。

麻痹性貝類毒素（PSP）是一種分布范圍廣、致死率高、危害最大的天然海洋生物毒素，主要由亞歷山大藻屬的甲藻產(chǎn)生[8-9]，分為三類，分別為：氨基甲?；惗舅兀╟arbamoyl toxin），包括石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（NEO）、膝溝藻毒GTX1、GTX2、GTX3和GTX4；氨甲?；?N-磺基類毒素（N-sulfocarbamoyl toxin），包括C1、C2、C3、C4、GTX5（B1）和GTX6（B2）；去氨甲酰基類毒素（decarbamoyl toxin），包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4[10-12]。但是，食用含有麻痹毒素的貝類后會(huì)造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而產(chǎn)生麻痹作用[13-16]，中毒初期會(huì)有口舌刺痛、麻木的感覺(jué)，隨后可能會(huì)出現(xiàn)四肢失控，繼而呼吸困難，嚴(yán)重者甚至?xí)旅Ｄ壳斑€沒(méi)有能治療麻痹性貝類毒素中毒的特效藥[17-18]，一旦中毒，基本只能依靠自身的解毒機(jī)能分解、清除毒素。因此，對(duì)貝類中的麻痹毒素進(jìn)行監(jiān)控十分必要。

常用的檢測(cè)方法有小鼠生物測(cè)定法、酶聯(lián)免疫分析法、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。LC-MS/MS由于具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，因此在貝類毒素的檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)[19-22]。試驗(yàn)主要對(duì)LC-MS/MS法檢測(cè)麻痹性貝類毒素的技術(shù)進(jìn)行深入研究，以期摸索一套簡(jiǎn)便易操作的方法進(jìn)行推廣，為貝類毒素的監(jiān)管提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

海白螺（市售）。

PSP標(biāo)準(zhǔn)品：石房哈毒素（STX，66.3±1.4 μmol/L）、新石房哈毒素（NEO，65.1±2.1 μmol/L）、膝溝藻毒素1&4（GTX1&4，75.1±2.1 μmol/L）、膝溝藻毒素2&3（GTX2&3，146.1±6.9 μmol/L）、N-磺酰胺甲?；舅兀℅TX5，53.6±2.9 μmol/L）、脫氨甲?；显宥舅?&3（dcGTX2&3，129.5±8.0 μmol/L）、脫氨甲?；抗舅兀╠cSTX，65.0±1.8 μmol/L），加拿大海洋研究中心。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨（均為色譜純）。

Prime HLB小柱、MAX小柱（美國(guó)Waters公司）。

QuEChERS鹽包：含5 g硫酸鎂、2 g氯化鈉、150 mg C18粉末。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

液相色譜儀質(zhì)譜聯(lián)用儀（AB 5500+，美國(guó)AB SCIEX公司）；純水儀（MILLI-Q型，美國(guó)Millipore公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；氮吹儀；均質(zhì)器；渦旋振蕩器；超聲波清洗機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理方法

1.2.1.1 樣品制備

新鮮的貝類用清水沖洗干凈，去殼，取出貝肉瀝水后放入勻漿機(jī)中勻漿，倒入樣品瓶中于-20 ℃冰箱中冷凍儲(chǔ)存，備用。

1.2.1.2 提取

稱取2 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，加10 mL 0.5%甲酸水，渦旋混勻5 min，超聲提取5 min，于100 ℃水浴提取5 min，然后按10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一支50 mL離心管中。

1.2.1.3 凈化

提取液中加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混合1 min，按10 000 r/min離心10 min，棄去上層溶液。再加入10 mL三氯甲烷，渦旋混合1 min，按10 000 r/min離心10 min，取3 mL上層溶液分別加入Prime HLB中，收集流出液到15 mL刻度離心管中，加1 mL甲酸溶液（0.5%）至固相萃取柱中，收集流出液至3.5 mL。用5%甲酸水調(diào)節(jié)至pH 3.0，乙腈定容至8 mL。渦旋混勻后放置5 min，取1 mL過(guò)0.22 μm濾膜，所得濾液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱Hilic（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，流動(dòng)相A為5 mmol/L甲酸銨（0.5%甲酸）溶液，流動(dòng)相B為0.5%甲酸乙腈溶液。流動(dòng)相洗脫程序：0～2 min，10% A；2～2.1 min，10%～30% A；2.1～4 min，30% A；4～4.1 min，30%～60% A；4.1～7 min，60% A；7～7.1 min，60%～10% A；7.1～12 min，10% A。

1.2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行正負(fù)離子同時(shí)掃描，噴霧電壓4 500/-4 500 V，離子源溫度550 ℃，DP電壓100/-100 eV，麻痹性貝類毒素的母離子、子離子、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 麻痹性貝類毒素監(jiān)測(cè)離子及碰撞能量

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

將10種PSP標(biāo)準(zhǔn)品配成單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以針泵方式進(jìn)樣，分別對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行正負(fù)離子掃描，在全掃描模式下，STX、dcSTX、neoSTX正離子模式下響應(yīng)較高，確定的母離子分別為300.2，257.1和316.1。GTX1&4、GTX2&3、GTX5、dcGTX2&3在負(fù)離子模式下響應(yīng)較高，確定的母離子分別為410.1，394，378.1和351.1。通過(guò)二級(jí)掃描，確定子離子，詳見(jiàn)表1，進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，確定去簇電壓和碰撞能，PSP各組分的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 PSP各組分定量離子色譜圖

2.2 色譜柱的選擇

配制100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用Waters的BEH Hilic色譜柱和島津的Amide色譜柱上機(jī)分離，在相同的流動(dòng)相條件下Waters的BEH Hilic色譜柱分離效果及峰型較好，所以試驗(yàn)選擇Waters的BEH Hilic色譜柱進(jìn)行分離。

2.3 樣品凈化條件的選擇

提取液中加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混合1 min，按10 000 r/min離心10 min，棄去上層溶液。再加入10 mL三氯甲烷，渦旋混合1 min，按10 000 r/min離心10 min，各取3 mL上層溶液分別加入Prime HLB、MAX柱（MCX柱使用前需依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 0.5%的甲酸水溶液活化），收集流出液到10 mL刻度離心管中，加1 mL甲酸溶液（0.5%）至SPE小柱中，收集流出液至3.5 mL。用5%甲酸水調(diào)節(jié)至pH 3.0，乙腈定容至8 mL。渦旋混勻后放置5 min，取1 mL過(guò)0.22 μm濾膜，所得濾液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

同時(shí)，另取5 mL經(jīng)乙酸乙酯和三氯甲烷除雜的上層溶液注入裝有QuEChERS鹽包的離心管，渦旋混勻1 min，按10 000 r/min離心5 min，取上清液通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾，所得濾液供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

幾種凈化方式相比，QuEChERS鹽包操作上最簡(jiǎn)便快捷，其次是Prime HLB，最后是MAX小柱。通過(guò)加標(biāo)回收測(cè)定，Prime HLB小柱凈化雜峰最少，有效改善峰型，回收率最好，均在80%以上，其次是MCX小柱，回收率在72%以上，回收率最低的為QuEChERS鹽包，僅有60%左右。綜合考慮，確定用Prime HLB小柱凈化。

2.4 線性范圍、回收率、精密度和定量限

考慮到樣品基質(zhì)對(duì)液質(zhì)法測(cè)定PSP的影響，以海白螺空白基質(zhì)處理液配制10～400 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線各點(diǎn)分別為10，20，50，100，200和400 ng/mL，以PSP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到的回歸方程的相關(guān)系數(shù)均在0.995以上，線性范圍良好，詳見(jiàn)表2。

表2 麻痹性貝類毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)

選取160，800和1 600 μg/kg高、中、低3個(gè)含量水平，用海白螺做基質(zhì)進(jìn)行回收率測(cè)試，3個(gè)點(diǎn)的平均回收率均在80.8%～93.3%之間，每個(gè)加標(biāo)點(diǎn)連續(xù)進(jìn)樣6針的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，詳見(jiàn)表3。

表3 麻痹性貝類毒素的回收率、精密度（n=6）

在空白樣品中添加24 μg/kg的麻痹毒素標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)提取凈化處理后上機(jī)測(cè)定，各組分峰的信噪比均大于10，因此，將24 μg/kg作為各組分的定量限。

3 結(jié)論

貝類是深受大眾喜愛(ài)的一種海鮮產(chǎn)品，但由于麻痹毒素中毒事件的頻發(fā)，非常有必要建立快速、準(zhǔn)確的毒素檢測(cè)方法。由于麻痹毒素是一類四氫嘌呤三環(huán)化合物，分子量較低，沒(méi)有紫外吸收，易溶于水，微溶于甲醇和乙醇，不溶于非極性溶劑，根據(jù)麻痹毒素的物理及化學(xué)性質(zhì)，建立用0.5%甲酸水作為提取液，非極性有機(jī)溶劑乙酸乙酯和三氯甲烷除雜，Prime HLB小柱凈化，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定10種貝類毒素的檢測(cè)方法，同時(shí)優(yōu)化凈化的條件、色譜及質(zhì)譜條件，降低基質(zhì)對(duì)樣品中麻痹毒素定量的干擾。通過(guò)加標(biāo)回收驗(yàn)證，該方法回收率較高、重現(xiàn)性較好，可用于貝類中麻痹毒素的檢測(cè)。