王東方，楊 陽，黃興法,2，劉玉蘭，胡 進(jìn)*

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；2.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430074）

腸外致病性大腸桿菌（，ExPEC）是一種主要的人畜共患病原，是臨床標(biāo)本中最常見的病原菌之一。ExPEC 根據(jù)分離位點(diǎn)或者宿主的不同，主要可以分為尿路致病性大腸桿菌（UPEC）、新生兒腦膜炎大腸桿菌（NMEC）、膿毒癥大腸桿菌（SEPEC）和禽致病性大腸桿菌（APEC）4 種類型。ExPEC 不僅危害人體健康導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，也給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重威脅，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。其中豬源ExPEC 主要導(dǎo)致豬的肺炎、腎炎、腦膜炎以及敗血癥等疾病的發(fā)生。21 世紀(jì)以來，豬大腸桿菌病已給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了許多嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，特別是高致病力的ExPEC 已在豬群中廣泛流行并嚴(yán)重致病。如2011 年我國大型養(yǎng)豬場發(fā)生了由ExPEC 引起的急性膿毒癥、肺炎和腦膜炎的暴發(fā)，造成豬場嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此豬源ExPEC 成為養(yǎng)殖業(yè)亟需解決的問題。大腸桿菌感染機(jī)體后往往能夠造成機(jī)體多臟器的各種損傷，包括變性、壞死、充血、出血、炎性細(xì)胞浸潤以及腫脹等。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC 感染能夠引起巨噬細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡等情況。ExPEC 通過引起細(xì)胞脫落和胞質(zhì)損傷后進(jìn)入細(xì)胞造成細(xì)胞損傷，最后通過造成組織損傷出血從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。已有研究證明，副豬嗜血桿菌能夠造成豬血管內(nèi)皮細(xì)胞（Porcine Aortic Vascular Endothelial Cells，PAVECs）發(fā)生損傷。由此猜測豬源ExPEC 感染后可能會(huì)引起PAVECs 發(fā)生死亡（凋亡、壞死等）。因此本試驗(yàn)主要探究豬源腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）感染4 h 對(duì)豬血管內(nèi)皮細(xì)胞（PAVECs）的致病機(jī)制，對(duì)于ExPEC 感染對(duì)PAVECs的致病機(jī)制進(jìn)行了更進(jìn)一步地探討，為預(yù)防和控制腸外致病性大腸桿菌提供理論依據(jù)，進(jìn)而促進(jìn)我國畜牧業(yè)穩(wěn)步向前發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑 RNAiso Plus 裂解液、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRPremix Ex Taq試劑盒均購置于日本TaKaRa 公司；氯仿、異丙醇和乙醇均購自于國藥集團(tuán)；磷酸鹽緩沖液（PBS）購于Hyclone 公司；Medium 199基礎(chǔ)培養(yǎng)基、表皮生長因子（EGF）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、雙抗（PSF）和促貼壁因子（ITS-X）均購于Gibco 公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 25 mL 胎牛血清（FBS）；5 mL雙抗（PSF）；500 μL 促貼壁因子（ITS-X）；250 μL表皮生長因子（EGF）一起加入M199 基礎(chǔ)培養(yǎng)基定容至500 mL。充分混合均勻后過濾，分裝到50 mL 離心管中，封口膜封口后置于4℃冰箱儲(chǔ)存待用。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取10 μL ExPEC PPECC042 菌液接種在TSA 固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇，37℃條件下120 r/min，培養(yǎng)12 h。挑取復(fù)蘇后的單菌落接種在TSB 液體培養(yǎng)基上復(fù)壯，37℃條件下120 r/min，培養(yǎng)12 h 后待用。復(fù)壯后的菌液進(jìn)行等濃度梯度稀釋，取稀釋后的菌液涂布到細(xì)菌培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)菌長好后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)菌數(shù)量。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的PAVECs 細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，置于5% CO，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)到90% 左右時(shí)，用胰酶進(jìn)行消化，傳代2～3次待細(xì)胞穩(wěn)定后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 細(xì)胞形態(tài) PAVECs 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種于6孔板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后取經(jīng)過稀釋后的ExPEC PPECC042 細(xì)菌懸液進(jìn)行感染（MOI=100:1），感染的細(xì)菌數(shù)為1×10CFU。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，每孔加入1 mL 稀釋后的細(xì)菌懸液，對(duì)照組（CON）每孔加1 mL無抗M199 培養(yǎng)基，放入5% CO，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。當(dāng)細(xì)胞正常狀態(tài)和細(xì)菌感染后分別在顯微鏡下（40 倍）觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.3.2 mRNA 表達(dá)量測定 ExPEC PPECC042 感染4 h 后，棄去上清，用PBS 潤洗兩遍后每孔加入1 mL RNAiso Plus 裂解液，靜置，吹打收樣待檢測。樣品經(jīng)過提取、沉淀清洗以及稀釋等步驟得到細(xì)胞總RNA，再根據(jù)RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明將總RNA 反轉(zhuǎn)為cDNA。以NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載的豬源基因組序列為模板，利用Premier 6.0 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由武漢擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行合成，引物序列詳見表1。最后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析PAVECs 炎癥、程序性壞死和焦亡信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量。炎癥、程序性壞死和焦亡相關(guān)基因Real-time PCR 數(shù)據(jù)分析以為內(nèi)參基因，均采用Livak 等的2計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算，最終結(jié)果使用歸一化法。

表1 基因的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）來表示，以<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著，>0.05 表示差異不顯著。圖表均采用Graphpad Prism 8.0.2 繪圖軟件進(jìn)行制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 ExPEC PPECC042 感染PAVECs 形態(tài)圖 由圖1 可知，在正常狀態(tài)下（CON 組），PAVECs 細(xì)胞為卵圓形，單層細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石狀”排列，并且形成許多細(xì)胞集落；但是在感染ExPEC PPECC042 后（042 組）細(xì)胞發(fā)生皺縮，甚至死亡，細(xì)胞的附著能力下降，并且有大量細(xì)菌黏附在細(xì)胞表面，細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，表明ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 有損傷作用。

圖1 ExPEC PPECC042 感染PAVECs 形態(tài)圖（40×）

2.2 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 炎癥相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響 由圖2 可知，ExPEC PPECC042感染PAVECs（4 h）后，炎性基因和的mRNA表達(dá)量上調(diào)（<0.01），的mRNA 表達(dá)量上調(diào)（<0.05）。結(jié)果表明，ExPEC PPECC042 感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生炎癥反應(yīng)。

圖2 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 炎癥信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響

2.3 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響 由圖3 可知，ExPEC PPECC042 感染PAVECs（4 h）后，程序性壞死相關(guān)基因和的mRNA 表達(dá)量上調(diào)（<0.05），的mRNA 表達(dá)量無顯著變化。結(jié)果表明，ExPEC PPECC042 感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生程序性壞死。

圖3 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響

2.4 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 焦亡信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響 由圖4 可知，ExPEC PPECC042 感染PAVECs（4 h）后，焦亡相關(guān)基因和的mRNA 表達(dá)量上調(diào)（<0.01），的mRNA 表達(dá)量上調(diào)（<0.05），而ASC 的mRNA 表達(dá)量無顯著變化。結(jié)果表明，ExPEC PPECC042 感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生細(xì)胞焦亡。

圖4 ExPEC PPECC042 感染對(duì)PAVECs 焦亡信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量的影響

3 討論

大腸桿菌（）是一種重要的人畜共患病病原。目前，根據(jù)臨床感染情況可將大腸桿菌分為腸道內(nèi)致病性大腸桿菌和ExPEC。ExPEC 是可以引起腸道外組織器官感染的一種嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康的人畜共患病病原。已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道了ExPEC 相關(guān)的毒力因子、分離鑒定、流行病學(xué)以及耐藥性等，但對(duì)其致病機(jī)制的研究較少，因此本試驗(yàn)主要對(duì)ExPEC 的致病機(jī)制進(jìn)行探究。ExPEC 感染能夠引起巨噬細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡等，研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC 感染巨噬細(xì)胞以后，環(huán)氧合酶-2（COX-2）以及抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)量顯著增加。ExPEC 感染大鼠后能夠?qū)е麓笫蠼Y(jié)腸中等基因的表達(dá)量顯著上調(diào)。炎癥和細(xì)胞死亡密切相關(guān)，而機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的過程其實(shí)是由機(jī)體內(nèi)的多種炎性介質(zhì)相互作用所介導(dǎo)的過程，在此期間它能夠激活血管內(nèi)皮細(xì)胞。炎癥也可以促進(jìn)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的激活，促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)mRNA 的表達(dá)，從而促進(jìn)以及等的合成與釋放。本試驗(yàn)中炎癥相關(guān)基因和的mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)，證明豬源ExPEC菌株感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生炎癥反應(yīng)。而程序性壞死作為一種新的細(xì)胞死亡方式，是目前研究的一大熱點(diǎn)。程序性壞死是在凋亡被抑制時(shí)發(fā)生的一種由死亡受體介導(dǎo)的Caspase 非依賴性細(xì)胞死亡模式。本試驗(yàn)所探究的程序性壞死相關(guān)基因和是程序性壞死信號(hào)通路中的核心調(diào)控基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，證明豬源ExPEC 菌株感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生程序性壞死。另外有研究表明肺炎鏈球菌可以誘導(dǎo)依耐性的產(chǎn)生，與促炎因子級(jí)聯(lián)相關(guān)聯(lián)。而采用豬源ExPEC 菌株感染PAVECs（4 h）后是否能夠引起細(xì)胞細(xì)胞焦亡的發(fā)生相關(guān)報(bào)道較少，因此本試驗(yàn)做了相關(guān)基因mRNA 表達(dá)量檢測，發(fā)現(xiàn)和的mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)，證明豬源ExPEC 菌株感染可能誘導(dǎo)PAVECs 發(fā)生細(xì)胞焦亡。另外，本試驗(yàn)還通過顯微鏡觀察到豬源ExPEC 菌株感染4 h 后導(dǎo)致PAVECs 的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，造成細(xì)胞受損。綜上所述，ExPEC PPECC042 可能通過激活炎癥、程序性壞死和焦亡信號(hào)通路導(dǎo)致PAVECs 發(fā)生損傷。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ExPEC 感染PAVECs 4 h 后細(xì)胞發(fā)生皺縮，甚至死亡；炎性基因（和）、程序性壞死相關(guān)基因（和）以及焦亡相關(guān)基因（和）的mRNA 表達(dá)量均顯著上調(diào)。以上結(jié)果表明ExPEC PPECC042 感染（4 h）能夠?qū)е翽AVECs 發(fā)生損傷，并且可能誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、程序性壞死以及細(xì)胞焦亡的發(fā)生。