王 曼，李 敏，何元慶，熊兆龍，何 健*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010；2.四川鐵騎力士集團(tuán)馮光德試驗(yàn)室，四川綿陽 621010）

我國是禽肉、蛋生產(chǎn)和消費(fèi)大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年中國在產(chǎn)蛋雞平均存欄量達(dá)10.7 億只，較2019 年增加了0.23 億只，同比增長2.20%，蛋雞產(chǎn)量達(dá)1 895.65萬t。2020 年全國黃羽肉雞和白羽肉雞出欄量約93 億只，占全部肉禽出欄量的55%。在禁抗之前，大量的抗生素促生長劑（AGPs）被用到家禽飼料中，發(fā)揮其促生長及預(yù)防動(dòng)物疾病的作用。我國自2020 年7 月1日起，飼料企業(yè)要停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。在此背景下，在家禽生產(chǎn)中選擇安全有效的抗生素替代產(chǎn)品具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)意義。

博落回（（.）.）屬罌粟科草本植物，世界各地均有生長，具有很大開發(fā)潛力。大量的研究發(fā)現(xiàn)博落回提取物有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等功效，是良好的抗生素促生長劑替代產(chǎn)品。2012 年，農(nóng)業(yè)部（后為農(nóng)業(yè)農(nóng)村部）將博落回批準(zhǔn)為中獸藥類藥物飼料添加劑。動(dòng)物免疫功能提升有益于機(jī)體識(shí)別和消滅外來侵入的任何異物（病毒、細(xì)菌等），若動(dòng)物免疫功能低下，會(huì)更容易感染病毒造成疾病和死亡，因此大量有關(guān)畜禽飼糧和添加劑的研究主要集中在提高免疫力這一領(lǐng)域。目前對(duì)于博落回的增強(qiáng)免疫力作用已有相關(guān)研究，但均是基于健康個(gè)體的研究，而博落回對(duì)于免疫抑制個(gè)體的作用少有探究，也未見系統(tǒng)報(bào)道。本文以博落回提取物為受試物，建立免疫抑制模型，檢測蛋雛雞生長性能和免疫功能相關(guān)指標(biāo)，探討博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞生長性能和免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)使用的博落回提取物由湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司提供，有效成分含量為3.75%，其中白屈菜紅堿和血根堿的比例為1:2。環(huán)磷酰胺購買于Sigma 生物公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)日糧 本試驗(yàn)選取1 日齡、體重為（38.76±1.12）g 的蛋雛雞120 只，按照體重一致、公母各半的原則隨機(jī)分為3 個(gè)處理，每處理40 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只雞，每只雞單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)期21 d。對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組飼喂基礎(chǔ)日糧，博落回組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加40 mg/kg 博落回提取物。于試驗(yàn)第8、9、10、17 天，環(huán)磷酰胺組和博落回組腹腔注射80 mg/kg BW 環(huán)磷酰胺，每天注射1 次，共注射4 d。對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。本試驗(yàn)于2020 年4 月—2020年5 月在鐵騎力士花荄試驗(yàn)基地進(jìn)行，選用一棟雞舍進(jìn)行飼養(yǎng)。試驗(yàn)所用基礎(chǔ)日糧為玉米-豆粕型日糧，飼糧按照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 33-2004）中的蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，按照鐵騎力士綿陽B 廠的正常生產(chǎn)工藝進(jìn)行配制，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 蛋雛雞日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)于2020 年4 月在鐵騎力士花荄實(shí)驗(yàn)基地雞舍進(jìn)行，試驗(yàn)前嚴(yán)格生物防控安全措施，打掃雞舍，清洗、消毒雞籠和水瓶，室溫、相對(duì)濕度和光照按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)程序操作。采取自由采食和自由飲水方式。試驗(yàn)期間每天觀察雞的飲水，采食量和精神狀態(tài)，保持雞舍及料槽清潔、干燥、衛(wèi)生。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 生長性能 在試驗(yàn)開始、7 d 和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空腹12 h 后測量雛雞體重，按照重復(fù)計(jì)算平均日增重。每日記錄每個(gè)處理的采食量。

1.4.2 血液指標(biāo)檢測 在試驗(yàn)21 d 結(jié)束時(shí)每個(gè)組隨機(jī)抽取10 只雞采集靜脈血兩管，分別為10 mL 普通管和5 mL 抗凝管。5 mL 抗凝管4 ℃保存待測血常規(guī)。10 mL 普通管37 ℃水浴30 min 后，3 500 r/min 離心10min，收集血清，-20℃保存待測。將抗凝管中的血樣送綿陽市中心醫(yī)院進(jìn)行血常規(guī)測定，主要檢測白細(xì)胞數(shù)目（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞積壓（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW）、血小板數(shù)目（PLT）、平均血小板體積（MPV）、血小板分布寬度（PDW）、血小板積壓（PCT）。用抗氧化試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定血清中丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽S 轉(zhuǎn)移酶（GSH-S）。用全自動(dòng)生化分析儀（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，BK-500）測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、總蛋白（TP）。用購自南京建成生物工程研究所的 ELISA 試劑盒測定血清中免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子（TNF-）濃度。

1.4.3 臟器指數(shù) 在試驗(yàn)21 天結(jié)束時(shí)每個(gè)組隨機(jī)抽取10 只雞進(jìn)行稱重，屠宰，摘取肝臟、脾臟和法氏囊。用電子天平對(duì)每只雞的肝臟、脾臟、法氏囊稱重，并分別以相應(yīng)的每只雞屠體重為分母，計(jì)算出器官指數(shù)。

器官指數(shù)=器官重量（g）/屠體重（kg）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)先采用Excel 2016 進(jìn)行整理，通過SAS 8.1 軟件GLM 模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，每個(gè)指標(biāo)以每只雞為統(tǒng)計(jì)單位，差異顯著再進(jìn)行Duncan's 多重比較，以<0.05 為差異顯著，結(jié)果以平均重±標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行顯示。

2 結(jié)果

2.1 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞生長性能的影響 由表2 可知，蛋雛雞在未注射環(huán)磷酰胺階段（試驗(yàn)0～7 d），博落回組與對(duì)照組相比可以提高蛋雛雞的平均日增重（<0.05）。在試驗(yàn)7～14、14～21 d 和7～21 d 階段，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組平均日增重和日采食降低（<0.05）。在試驗(yàn)7～14 階段，博落回組與對(duì)照組相比耗料增重比提高（<0.05）。在14～21 d 和7～21 d階段，與對(duì)照組相比，博落回組的平均日增重和日采食降低（<0.05）。在試驗(yàn)7-14 d 階段，與環(huán)磷酰胺組相比，博落回組的平均日采食提高（<0.01）。在試驗(yàn)14～21 d和7～21 d 階段，與環(huán)磷酰胺組相比，博落回組的平均日增重和平均日采食量提高（<0.01），耗料增重比降低（<0.01）。

表2 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞生長性能的影響

2.2 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血常規(guī)的影響 如表3 所示，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組血液中WBC 的含量降低（<0.01）。博落回組血液中WBC、RBC、HGB、HCT 和MCH 含量較環(huán)磷酰胺組提高（<0.05）；與對(duì)照組相比，博落回組血液中HGB 和HCT 含量提高（<0.05）。

表3 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.3 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血清生化的影響 如表4 所示，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組雛雞血清中ALT和AST 活性提高（<0.05），血清TP 和GLOB 含量降低（<0.05）。與環(huán)磷酰胺組相比，博落回組血清中的ALT 和AST 活性降低（<0.05），血清TP 和GLOB含量提高（<0.05）。

表4 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血清生化指標(biāo)的影響

2.4 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血清抗氧化的影響由表5 可知，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組血清中MDA含量提高（<0.05）。博落回組與血清中MDA 含量與環(huán)磷酰胺組比降低（<0.05）。

表5 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞抗氧化能力的影響

2.5 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞血清免疫因子的影響 由表6 可知，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組IgG、IgM、IL-1和IL-10 含量降低（<0.05）。博落回組血清中IgG、IgM、IL-1、IL-6 和IL-10 含量與環(huán)磷酰胺組比提高（<0.05）。

表6 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞免疫力的影響

2.6 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞器官指數(shù)的影響由表7 可知，與環(huán)磷酰胺組相比，博落回組肝臟指數(shù)降低（<0.05），法氏囊指數(shù)提高（<0.05）。博落回組法氏囊指數(shù)較對(duì)照組提高（<0.05）。

表7 博落回提取物對(duì)免疫抑制蛋雛雞器官指數(shù)的影響

3 討論

免疫應(yīng)激是機(jī)體受到外力作用而喪失免疫穩(wěn)態(tài)的狀況，免疫應(yīng)激分為激活和抑制2 種相反的狀態(tài)。實(shí)際生產(chǎn)中疫苗超量注射引發(fā)的免疫應(yīng)激就是免疫過度激活，而霉菌毒素中毒可引起免疫抑制?？茖W(xué)研究中常用注射環(huán)磷酰胺建立動(dòng)物免疫抑制模型。大量的研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物免疫抑制模型建立成功后會(huì)降低動(dòng)物的生長性能，免疫相關(guān)指標(biāo)也會(huì)受到抑制。本試驗(yàn)中，注射環(huán)磷酰胺降低了蛋雛雞的生長性能，蛋雛雞的免疫細(xì)胞增殖受到抑制，同時(shí)抑制了蛋雛雞免疫細(xì)胞分泌免疫因子的能力，結(jié)果與He、Jones、Chen 等、Tripathi 等等的研究結(jié)果一致，表明本試驗(yàn)環(huán)磷酰胺在蛋雛雞上的免疫抑制模型成功建立。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫抑制蛋雛雞的日糧中添加博落回提取物可以顯著改善蛋雛雞的平均日增重和采食量，但耗料增重比提高。Liu 等研究發(fā)現(xiàn)免疫應(yīng)激會(huì)下調(diào)血漿腎上腺素活性、血清血管緊張素II 和淀粉酶活性，對(duì)肉雞能量的利用產(chǎn)生負(fù)面影響。這與本試驗(yàn)中環(huán)磷酰胺注射導(dǎo)致耗料增重比提高的結(jié)果一致。添加博落回提取物可以降低耗料增重比，促進(jìn)采食量和日增重，這表明博落回提取物可以改善免疫抑制雞的生長性能，減輕環(huán)磷酰胺給雞生長帶來的負(fù)面影響。Khadem等研究發(fā)現(xiàn)隨著飼糧中博落回提取物劑量的增加肉雞生長性能也逐步增加，這與本試驗(yàn)結(jié)論一致。

不同種類的白細(xì)胞以不同的方式參與機(jī)體的防御反應(yīng)，研究表明免疫抑制會(huì)降低機(jī)體內(nèi)白細(xì)胞含量，表明機(jī)體抵抗力下降。Girard 等在小鼠上注射環(huán)磷酰胺建立免疫抑制模型，小鼠體內(nèi)WBC 顯著降低。而白介素是由白細(xì)胞產(chǎn)生，WBC 降低也會(huì)導(dǎo)致白介素含量的降低，這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。在本試驗(yàn)中，添加了博落回提取物可以顯著改善免疫抑制造成的血清中WBC 和白介素含量的降低，同時(shí)RBC、HGB、HCT 及MCH 含量都相應(yīng)提高。紅細(xì)胞不僅參與體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送，同時(shí)還具有免疫功能。Vrba 等研究發(fā)現(xiàn)血根堿通過激活Nrf2 信號(hào)通路來調(diào)節(jié)血紅素加氧酶1（HO-1）的表達(dá)，但白屈菜紅堿無法影響該通路。因此，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與組相比，添加博落回提取物可以提高血液中RBC 及HGB 含量，這可能與博落回提取物中的血根堿參與該通路有關(guān)。

環(huán)磷酰胺注射到機(jī)體內(nèi)，需要經(jīng)過肝臟代謝活化才能發(fā)揮作用，活化過程中會(huì)消耗肝臟微粒體細(xì)胞色素酶P450，并且增加活性氧含量，迅速耗竭谷胱肝肽（GSH），引發(fā)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而造成肝細(xì)胞損傷。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組的MDA 大量升高，肝臟指數(shù)上升6.34%。肝臟的輕微損傷會(huì)引起血液中ALT 和AST 含量升高。同時(shí)，肝臟損傷時(shí)血液中蛋白含量會(huì)降低，免疫球蛋白也顯著降低。本試驗(yàn)中，注射環(huán)磷酰胺導(dǎo)致蛋雛雞血液中ALT 和AST 含量上升，這與前人的研究結(jié)果一致。添加博落回提取物后，血液中ALT、AST 和MDA 含量下降，同時(shí)肝臟指數(shù)也顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)博落回成分具有清除自由基的能力，具有很好的抗氧化活性，使蛋白質(zhì)避免出現(xiàn)氧化損傷和羰基化損傷，使脂質(zhì)及DNA 氧化損傷受到抑制。這表明博落回提取物具有抗氧化功能，修復(fù)肝臟損傷，從而降低血液中ALT 和AST 含量。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺能抑制蛋雛雞的免疫能力，降低雛雞的生長性能。博落回對(duì)免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，能提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制雞的免疫能力，維持免疫細(xì)胞的正常功能，提高抗氧化能力，保護(hù)肝臟等組織，維護(hù)機(jī)體健康及生長發(fā)育。