張繼虎，隋志遠(yuǎn)，李慶瑾，張志帥，邢 鳳*

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300）

初情期是動(dòng)物初次發(fā)情并排卵的時(shí)期，,也是繁殖能力開始的時(shí)期。下丘腦-垂體-性腺軸（Hypothalamic-pituitary-gonad Axis，HPG 軸）在 初情期的啟動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用，其中初情期開始的標(biāo)志是下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）的脈動(dòng)性分泌刺激垂體促性腺激素細(xì)胞中基因的表達(dá)。垂體GnRHR 和GnRH 結(jié)合可激活下游的幾個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)，包括肌醇1,4,5-三磷酸、絲裂原活化蛋白激酶、二酰甘油和腺苷酰環(huán)化酶途徑，促使促黃體生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的合成與釋放。FSH 和LH 能夠作用于性腺，使得性腺釋放各類類固醇激素，從而使動(dòng)物生殖器官開始發(fā)育直至成熟。具有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，還具有一個(gè)胞外氨基末端和一個(gè)胞內(nèi)COOH末端，是典型的G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員。自從在大鼠垂體中克隆得到第1 個(gè)后，許多物種GnRHR 也被成功克隆，其中包括鴨、雞、牛蛙、紋狀壁虎、黑鱸和蟹等動(dòng)物。

多浪羊具有肉質(zhì)好、初情期來臨早等優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)羔羊肉的理想品種，國內(nèi)外少有對(duì)多浪羊初情期基因及TA 克隆表達(dá)等相關(guān)的研究報(bào)道。因此，本研究利用克隆測(cè)序、生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法，對(duì)多浪羊基因的CDS 序列進(jìn)行克隆、分析以及測(cè)定初情期前、初情期和初情期后HPG 相關(guān)組織的表達(dá)量，為研究基因的功能和進(jìn)一步闡明GnRHR 如何影響綿羊初情期的啟動(dòng)過程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 于新疆麥蓋提縣良種多浪羊繁育中心，采用公羊試情法（每天10:00、18:00 2 次試情）和外陰觀察法，選取初情期前（90 日齡）、初情期（第1 次發(fā)情4～6 h 內(nèi)）和初情期后（初情期結(jié)束10 d 后）的多浪羊各5 只，取適量上述多浪羊的下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管5 種組織，無菌手術(shù)剪剪碎后放入凍存管中，迅速置于液氮中保存，并盡快轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑 DNA Marker2000、膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；PMD-19T 購自大連寶生物工程有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒、DH5感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；藍(lán)白斑試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 多浪羊RNA 提取與cDNA 合成 利用Transzol 法提取組織RNA，提取后的RNA 利用核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)濃度。檢測(cè)合格后，統(tǒng)一濃度進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)及基因的克隆 從GeneBank 上找到綿羊基因的mRNA 序列（登錄號(hào)為：NM_001009397.1），根據(jù)Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)基因克隆的引物（表1）。PCR 反應(yīng)體系：9.5 μL ddHO，12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，1 μL Primer-F（5 nmol/μL）、1 μL Primer-R（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反應(yīng)總體系為25 μL。反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min；重復(fù)35 個(gè)循環(huán)；72℃，5 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，做膠回收純化處理并與PMD-19T 載體連接，連接后在16℃條件下反應(yīng)30 min。取反應(yīng)好的連接產(chǎn)物5 μL 與100 μL DH5感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30 min 后，42℃條件下熱激90 s，然后快速轉(zhuǎn)入離心管中冰浴。隨后加入400 μL 不含氨芐青霉素的培養(yǎng)基，進(jìn)行搖床復(fù)蘇，條件為37℃，225 r/min，90 min。待溶液變渾濁后，4 000 rpm 離心5 min，棄掉適量上清液，將剩余菌液均勻鋪在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，放置30 min。將培養(yǎng)皿倒置，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。通過藍(lán)白斑試劑挑選重組子后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，合格菌液送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用測(cè)序獲得的序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，以為內(nèi)參基因。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 多浪羊GnRHR 克隆及熒光定量PCR 引物

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以多浪羊cDNA 為模板，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)各組織中的表達(dá)量。反應(yīng)體系：5.5 μL ddHO，7.5 μL 2×Transtant qPCR Mix 上下游引物各0.5 μL（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反應(yīng)總體系為15 μL。反應(yīng)條件：95℃，2 min；95℃，15 s；55℃，15 s；68℃，20 s，重復(fù)反應(yīng)40 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用2法計(jì)算得到的CT 值，使用SPSS 24.0 分析差異是否顯著。>0.05 表示差異不顯著，<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1基因的克隆 多浪羊基因通過PCR 擴(kuò)增后，用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1）?？梢钥闯觯? 170 bp 處有明顯的單一特異DNA 條帶，條帶大小符合預(yù)期，證明已成功擴(kuò)增出了多浪羊基因的CDS 序列。將得到的序列通過BLAST對(duì)比發(fā)現(xiàn)，多浪羊基因的CDS 序列與綿羊的同源性為99.90%。

圖1 多浪羊GnRHR 基因PCR 產(chǎn)物

2.2 同源序列對(duì)比及進(jìn)化樹構(gòu)建 通過NCBI 分別獲取犬（登錄號(hào)：NP_001003121.1_1）、雞（登錄號(hào)：NP_001012627.1_1）、牛（登錄號(hào)：XP_005208079.1_1）、綿羊（登錄號(hào)：NP_001009397.1_1）、小鼠（登錄號(hào)：NP_001297580.1_1）、人（登錄號(hào)：NP_000397.1_1）的CDS 序列，利用MEGA 7.0 構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，多浪羊與綿羊的親緣關(guān)系最近，同源性為99.90%，其次是牛，同源性為95.71%。

圖2 同源進(jìn)化樹構(gòu)建圖

2.3 GnRHR 蛋白生物信息學(xué)分析

2.3.1 GnRHR 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析 利用ExPASy軟件預(yù)測(cè)多浪羊GnRHR 蛋白的親水性和疏水性（圖3）及其理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)第68 位的谷氨酸（Glu）親水性最強(qiáng)，親水性分值為-3.589；第225 位的亮氨酸（Leu）疏水性最強(qiáng)，疏水性分值是3.300。GnRHR 氨基酸親水性/疏水性分布圖可以看出GnRHR 蛋白序列中疏水性的氨基酸區(qū)域多于親水性區(qū)域（圖3），疏水性總平均值為0.355，表明多浪羊GnRHR 屬于疏水蛋白。ExPASy 預(yù)測(cè)得出多浪羊GnRHR 蛋白的化學(xué)式為CHNOS；等電點(diǎn)為9.23；存在16 個(gè)帶負(fù)電殘基（天冬氨酸+谷氨酸）和26 個(gè)帶正電殘基（精氨酸+賴氨酸）；其N 末端氨基酸為蛋氨酸（Met），穩(wěn)定指數(shù)為32.28，屬于穩(wěn)定蛋白。

圖3 GnRHR 蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)

2.3.2 多浪羊GnRHR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 由圖4 可知，GnRHR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由-螺旋和無規(guī)卷曲組成，分別為38.41%和32.93%，其余結(jié)構(gòu)為延伸鏈和-轉(zhuǎn)角，分別為26.52%和2.13%。利用PHYRE2在線軟件，預(yù)測(cè)分析多浪羊GnRHR 的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5），該結(jié)構(gòu)基于c4djgA 模板進(jìn)行建模。

圖4 多浪羊GnRHR 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖5 多浪羊GnRHR 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

2.3.3 GnRHR 蛋白結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)分析 由圖6可知，多浪羊GnRHR 蛋白存在1 個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域和7個(gè)跨膜區(qū)域。預(yù)測(cè)到多浪羊GnRHR 蛋白氨基酸序列從第22 位到第33 位為低復(fù)雜度區(qū)域；存在7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，分別位于第39 到第58 位、第79 到101 位、第116 到第137 位、第158 到第180 位、第209 到第231 位、第270 到292 位、第307 到326 位氨基酸。由圖7 可知，GnRHR 蛋白存在7 個(gè)跨膜區(qū)域，跨膜區(qū)域起始位置與SMART 軟件預(yù)測(cè)序列一致。

圖6 多浪羊GnRHR 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)圖

圖7 多浪羊GnRHR 蛋白跨膜預(yù)測(cè)圖

2.3.4 GnRHR 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析 由圖8 可知，多浪羊基因編碼產(chǎn)物存在11 個(gè)絲氨酸、15 個(gè)蘇氨酸和1 個(gè)酪氨酸的潛力值大于閾值，表明多浪羊GnRHR 有26 個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

圖8 多浪羊GnRHR 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)圖

2.4基因初情期不同組織中的表達(dá) 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法對(duì)基因在多浪羊下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管5 種組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)（圖9）。結(jié)果顯示，基因在初情期前、初情期和初情期后3 個(gè)時(shí)期中，5 種組織均有表達(dá)，其趨勢(shì)均為初情期時(shí)升高，初情期后開始降低?；蛟诙嗬搜? 個(gè)時(shí)期中均為垂體和卵巢中高表達(dá)，下丘腦、子宮和輸卵管中低表達(dá)。初情期前基因在垂體中表達(dá)量相對(duì)較高，顯著高于下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管；進(jìn)入初情期時(shí)，垂體和卵巢中表達(dá)量最高，極顯著高于其他組織；初情期后垂體和卵巢相對(duì)表達(dá)量仍然較高，顯著高于其他組織。多浪羊垂體基因初情期時(shí)表達(dá)量極顯著高于初情期前和初情期后；初情期時(shí)卵巢中表達(dá)量顯著上升，初情期后卵巢中相對(duì)表達(dá)量開始下降，但并不顯著；初情期時(shí)下丘腦、子宮和輸卵管中表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，但差異并不顯著。

圖9 不同組織各時(shí)期GnRHR 相對(duì)分泌量

3 討論

本研究克隆出多浪羊基因CDS 序列，對(duì)其進(jìn)行同源比較以及構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，與綿羊的同源性最高，其次是牛，說明GnRHR 符合生物進(jìn)化的特點(diǎn)，反映了進(jìn)化過程中DNA 序列差異的功能限制。綿羊基因由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成，CDS 序列全長987 bp，編碼328 個(gè)氨基酸，是一個(gè)單一的拷貝基因。生物信息學(xué)分析顯示，多浪羊GnRHR 分子式為CHNOS，等電點(diǎn)為9.23，為堿性蛋白，與榕江小香羊GnRHR 蛋白CHNOS、等電點(diǎn)為9.39 相差不大，同屬于堿性蛋白；穩(wěn)定指數(shù)為32.51，其N 末端的蛋氨酸主要起到穩(wěn)定作用，屬于穩(wěn)定蛋白；疏水性總平均值為0.355，屬于疏水蛋白，其疏水性有利于該蛋白向內(nèi)折疊生成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)（主要是生成-螺旋以保證其穩(wěn)定性或者為跨膜蛋白），進(jìn)而生成特定的空間構(gòu)象和三級(jí)結(jié)構(gòu)以發(fā)揮其作用。軟件分析顯示該蛋白最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是-螺旋，為39.94%，同時(shí)利用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白存在7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，且預(yù)測(cè)其功能域時(shí)發(fā)現(xiàn)存在7 個(gè)跨膜區(qū)域，表明該蛋白屬于跨膜蛋白，與榕江小香羊GnRHR 蛋白跨膜區(qū)域一致，這與該蛋白為疏水蛋白相符合；該蛋白含有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能成為蛋白激酶和磷酸酶的修飾位點(diǎn)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)通路的過程中發(fā)揮著重要作用。

通路能夠促進(jìn)促性腺激素的合成與分泌，在動(dòng)物初情期的啟動(dòng)過程中發(fā)揮著重要的作用，其中基因是重要的介導(dǎo)者和組成部分。作為整合中心的下丘腦能夠產(chǎn)生脈動(dòng)性GnRH 刺激垂體細(xì)胞基因表達(dá)，激活早已經(jīng)建立好的垂體-性腺軸。進(jìn)入初情期的牦牛血清中GnRH 含量極顯著高于伐情期的牦牛且在24 h 內(nèi)有明顯的3 個(gè)峰值，同時(shí)Kadokawa 等證明哺乳動(dòng)物的GnRHR 聚集在促性腺激素的表面，并且隨著GnRH 濃度的升高而增加，表明哺乳動(dòng)物初情期時(shí)GnRH 能夠以脈沖的方式刺激垂體細(xì)胞基因從而發(fā)揮作用。初情期垂體分泌的LH 和FSH 隨血液循環(huán)到達(dá)卵巢，促進(jìn)卵泡發(fā)育和完善卵巢功能，刺激卵巢分泌雌激素，從而使動(dòng)物表現(xiàn)出第1 次發(fā)情和排卵。雌激素能夠直接作用于垂體，也可通過其正反饋過程中增加的GnRH 促使基因表達(dá)。與的相互作用能夠刺激對(duì)性腺功能有至關(guān)重要作用的促性腺激素合成與分泌，在初情期啟動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，通過使用藥物，能夠調(diào)控基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)人進(jìn)入青春期和小鼠進(jìn)入初情期的時(shí)間。Howard發(fā)現(xiàn)基因發(fā)生突變能夠阻礙性腺發(fā)育，造成繁殖障礙。本研究采用熒光定量PCR 的方法檢測(cè)了初情期和初情期前后3 個(gè)時(shí)期多浪羊基因在HPG 軸相關(guān)組織的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示基因在垂體中高表達(dá)，且初情期時(shí)表達(dá)量最高，與前人研究結(jié)果一致；但與甘家藏綿羊發(fā)情后期卵巢中表達(dá)量最高不一致，推測(cè)原因可能是不同時(shí)期基因表達(dá)存在差異。卵巢是除垂體外表達(dá)最高的組織，與小鼠卵巢和卵巢顆粒細(xì)胞中存在mRNA 的結(jié)果一致，同時(shí)也表明在初情期時(shí)對(duì)卵巢發(fā)揮其功能具有重要作用。龍威海等對(duì)不同品種山羊在不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黔北麻羊、貴州白山羊和小香羊垂體組織中表達(dá)量最高，在下丘腦、子宮、卵巢和輸卵管中均有表達(dá)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致；貴州黑山羊下丘腦組織中表達(dá)量最高，推測(cè)不一致原因?yàn)椴煌锓N不同環(huán)境下能夠影響基因表達(dá)。在HPG 軸相關(guān)組織初情期及初情期前后不同時(shí)期均有表達(dá)且表達(dá)量具有差異，說明基因?qū)d羊初情期的啟動(dòng)以及生殖系統(tǒng)的發(fā)育完善和維持正常的繁殖活動(dòng)密切相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究通過克隆獲得了多浪羊基因的CDS序列，該序列長987 bp，編碼328 個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)顯示該蛋白為疏水蛋白，屬于穩(wěn)定蛋白，存在7 個(gè)跨膜區(qū)域，有26 個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法，發(fā)現(xiàn)多浪羊基因在垂體中表達(dá)量最高，其次為卵巢，在HPG 軸相關(guān)組織中均有表達(dá)，表明基因在多浪羊初情期啟動(dòng)的過程中發(fā)揮著重要的作用。