崔 超，馬 駿，張 鑫，梁應嘉，楊少瀅,3，肖 成，劉 宇，金海國，曹 陽*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學院，吉林長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，吉林長春 130118；3.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 136200）

隨著生活質(zhì)量的提高，高品質(zhì)羊肉越來越受到消費者歡迎，如何提高羊肉品質(zhì)以及選育高品質(zhì)肉羊品種是目前需要解決的一大難題。家畜的肉質(zhì)與脂肪的含量密切相關(guān)，適量的肌內(nèi)脂肪含量可增加大理石花紋，降低剪切力，增加肉質(zhì)風味及適口性。影響肌內(nèi)脂肪的關(guān)鍵因素是遺傳因素。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白3（Bone Morphogenetic Protein 3，）是轉(zhuǎn)化生長因子-（TGF-）超家族的成員。目前關(guān)于基因的研究主要在調(diào)控心臟、骨骼、腎臟和胚胎發(fā)育以及母畜的生殖過程等方面，基因在成骨組織的形成和損傷后的修復過程中也起著重要作用，同時有部分報道證明基因在脂代謝中扮演著重要角色。本課題以雙乾肉羊為研究對象，通過Sanger 測序檢測基因第一外顯子的多態(tài)性，并綜合分析其與綿羊背最長肌脂肪酸相對含量之間的相關(guān)性，以期為后續(xù)探索影響肉質(zhì)性狀的候選基因提供素材。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用雙乾肉羊均來自吉林省農(nóng)業(yè)科學院試驗羊場，隨機選取健康且體況良好的雙乾肉羊49 只，斷奶后飼養(yǎng)6 個月屠宰，采集背最長肌進行脂肪酸含量檢測，采集肝組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器及試劑 動物組織DNA 快速提取試劑盒購自Axygen 公司；2×ES Taq Master Mix 購自北京康為世紀生物科技有限公司；Q5000 超微量分光光度計購自美國Quawell 公司；PCR 儀購自上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.3 組織樣DNA 提取 從肝組織中提取綿羊基因組DNA，并使用超微量分光光度計測定提取的DNA 濃度和純度，將DNA 樣品進行-80℃保存。

1.4 引物設計及合成 根據(jù)NCBI 網(wǎng)站所預測的羊基因（XM_027971127.2）外顯子序列，采用Primer 5.0 軟件設計基因第一外顯子引物，并由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列為F：5'-ACATCAGCCAGGGAACCGA-3'；R：5'-GCGACTGTC TAAAGGGCTAAGG-3'，擴增目的片段長度為1 494 bp。

1.5 綿羊基因PCR 產(chǎn)物擴增 PCR 反應體系如下：2×ES Taq Master Mix 10 μL（1×），上、下游引物（0.5 μmol/L）各0.5 μL，DNA（<250 ng/50 μL）1 μL，ddHO 補足至20 μL。PCR 反應過程如下：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，適宜退火溫度退火30 s，72℃延伸45 s，總共進行34 個循環(huán)，72℃延伸5 min，產(chǎn)物4℃保存。將PCR 產(chǎn)物取5 μL 進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測引物特異性。

1.6 綿羊基因多態(tài)性測序及分析 把擴增出的、條帶明亮的PCR 產(chǎn)物送到蘇州金唯智生物科技有限公司測序。使用DNAMAN 和Chromas 軟件通過對測序結(jié)果的序列及序列圖譜進行比對分析，進一步篩選SNP位點，統(tǒng)計并計算不同基因型頻率。

1.7 肌肉脂肪酸含量的檢測 用氣相色譜法進行肌肉脂肪酸的測量，方法參照“肉與肉制品脂肪酸測定”（GB/T9695.2-2008）。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用家養(yǎng)動物遺傳分析工具計算群體遺傳參數(shù)、檢驗，并分析判斷基因型是否處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。采用SPSS 23.0 軟件中One-Way ANOVA 對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析并用LSD 法進行多重比較，以明確不同基因型與雙乾肉羊肌肉脂肪酸含量的相關(guān)性，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，差異顯著性標準以<0.05 來判斷。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增產(chǎn)物 由圖1 可知，擴增片段長度約為1 494 bp，與預期大小一致，條帶明亮、單一、無雜帶，符合后續(xù)實驗要求。

圖1 BMP3 基因第1 外顯子的PCR 擴增電泳圖

2.2 綿羊基因PCR 產(chǎn)物測序及序列分析 測序結(jié)果通過DNAMAN 軟件比對分析發(fā)現(xiàn)SNPs 位點，在基因第1 外顯子276 bp 處發(fā)現(xiàn)G →A 突變（圖2），然后使用下游引物將49 個樣單獨測序，并用Chromas軟件對測序峰圖逐一比對，發(fā)現(xiàn)其有A 和G 2 個等位基因，AA、AG 和GG 3 種基因型（圖3）。

圖2 綿羊BMP3 基因外顯子1 核苷酸序列比對

圖3 綿羊BMP3 基因外顯子1 AA、AG 和GG 基因型的測序峰圖

2.3 綿羊基因多態(tài)位點遺傳多樣性分析 由表1 可知，綿羊群體基因第1 外顯子AA、AG 和GG 基因型頻率分別為44.9%、51.0% 和4.1%，因此AG 型為優(yōu)勢基因型。A、G 基因頻率分別為70.4% 和29.6%，因此A 為優(yōu)勢等位基因。根據(jù)卡方適合性檢驗結(jié)果并對照值表，判斷該位點在雙乾肉羊群體中處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（>0.05）。經(jīng)計算，雜合度（He）、純合度（Ho）和有效等位基因數(shù)（Ne）分別為0.420 0、0.580 0 和1.724，該位點屬于中度多態(tài)（0.25

表1 綿羊BMP3 基因不同突變位點基因型頻率及基因頻率

2.4基因不同基因型與綿羊肌肉脂肪酸含量的相關(guān)性 由表2 可知，基因外顯子1 的不同基因型個體間肌肉脂肪酸含量存在顯著性差異，綿羊基因A/G 位點3 種不同基因型對棕櫚油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量均有顯著性影響。其中AA 型的棕櫚酸和棕櫚油酸含量在該群體中均顯著高于AG 型，與GG 型個體間不存在顯著差異。GG 基因型的硬脂酸含量在該群體中顯著高于AA 型，與AG 型個體間不存在顯著差異。其余脂肪酸含量在3 種基因型間不存在顯著性差異。

表2 綿羊BMP3 基因多態(tài)性與脂肪酸關(guān)聯(lián)分析

3 討論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因?qū)儆赥GF-超家族，是一類都具有骨及軟骨誘導活性但理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及功能特點不盡相同的蛋白質(zhì)，參與骨和軟骨形成、胚胎發(fā)生、肌肉生長、脂肪形成、生殖系統(tǒng)發(fā)育甚至癌癥的發(fā)生?；蚴且粋€多功能基因，在調(diào)控心臟、骨骼及成骨組織的形成和損傷后的修復過程、腎臟和胚胎發(fā)育以及母畜的生殖過程中起重要作用，并對生殖、牙根的發(fā)育以及胎兒發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。劉建等研究表明，在骨折修復的早期誘導成骨中起重要作用。此外，也是一種腫瘤抑制因子，其活性喪失與甲狀腺乳頭狀癌、膽管癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。張小輝等發(fā)現(xiàn)在牛卵巢、肝等12 個組織中均有表達，并且脂肪組織中表達相對較高，這也說明可能參與脂肪代謝過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，BMP3/WISP1 信號通路在骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和脂肪生成中起著關(guān)鍵作用。脂肪含量是肉質(zhì)性狀的重要指標之一，與口感、風味密切相關(guān)。

本研究選取49 只雙乾肉羊作為研究對象，根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)基因第1 外顯子276 bp 處存在G/A 突變，優(yōu)勢基因型為AG 型，該位點在所測的雙乾肉羊群體中處于哈代-溫伯格平衡，說明該群體基因型幾乎不受人工選擇干涉的影響，隨著群體中隨機交配的進行，遺傳組成將保持不變，從而容易達到遺傳平衡狀態(tài)。群體遺傳學分析顯示，該位點屬于中度多態(tài)（0.25

肌肉中脂肪酸組成與肉品質(zhì)緊密相關(guān)，如肌內(nèi)脂肪含量與棕櫚酸呈明顯正相關(guān)，與亞油酸呈明顯負相關(guān)；部分脂肪酸之間也相互影響，如肉豆蔻酸和棕櫚酸呈明顯正相關(guān)，亞油酸與肉豆蔻酸和棕櫚酸均呈明顯負相關(guān)。棕櫚油酸（9-十六碳烯酸）含量與肉的風味之間存在著較高的正相關(guān)性，硬脂酸（十八碳酸）含量和口味之間有較高的負相關(guān)性，可能影響肉的膻味。本研究在綿羊群體中檢測不同基因型在肉中脂肪酸含量的差異，結(jié)果顯示，AA 基因型雙乾肉羊背最長肌中棕櫚酸和棕櫚油酸顯著高于AG 基因型個體，GG 基因型個體硬脂酸顯著高于AA 型，說明AA 基因型個體肉的風味品質(zhì)更高。本實驗初步推斷基因多態(tài)性對綿羊肉質(zhì)性狀有一定影響，下一步實驗應擴大樣本群體數(shù)進一步分析和驗證。

4 結(jié)論

雙乾肉羊基因第1 外顯子276 bp 處發(fā)現(xiàn)一個A/G 突變屬同義突變；AA 基因型個體背最長肌棕櫚油酸和棕櫚酸含量顯著高于AG 基因型，GG 基因型個體硬脂酸含量在雙乾肉羊群體中顯著高于AA 型，其余脂肪酸含量在3 種不同基因型間不存在顯著性差異。綜上，基因多態(tài)性對綿羊肌肉脂肪酸含量有一定影響，AA 型個體肉的風味品質(zhì)更高，在生產(chǎn)中具有優(yōu)勢，而GG 型個體可能與肉的膻味有關(guān)，相關(guān)結(jié)果可為后續(xù)綿羊肉質(zhì)性狀分子選育提供可參考的遺傳標記。