陸丹旭， 龔建英， 何延青， 郭嘉宇， 李潤(rùn)玲

（1.河北建筑工程學(xué)院市政與環(huán)境工程系，河北張家口 075000；2.河北省水質(zhì)工程與水資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北張家口 075000）

20世紀(jì)70年代，Schnell等［1］發(fā)現(xiàn)腐爛樹(shù)葉中含有一種重要的冰核物質(zhì)，開(kāi)啟了細(xì)菌成冰核作用的研究.隨后，Maki等［2］從腐爛的赤楊樹(shù)葉中提取分離得到了一種名為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)將這種細(xì)菌添加到0 ℃時(shí)依然為液體狀態(tài)的過(guò)冷卻水中就能催化誘導(dǎo)它形成冰晶，并把這種特性稱(chēng)作細(xì)菌的冰核活性. Lindow等［3］發(fā)現(xiàn)草生歐文氏菌（Erwinea herbicola）也是一種冰核細(xì)菌. 在這之后，許多國(guó)家的學(xué)者對(duì)冰核細(xì)菌深入研究，發(fā)現(xiàn)了具有同種特性的3個(gè)屬19個(gè)種或變種為冰核細(xì)菌［4］. 冰核細(xì)菌能夠在細(xì)胞外膜產(chǎn)生一類(lèi)特殊蛋白質(zhì)——冰核活性蛋白（ice nucleation protein，INP）［5-8］，INP 是細(xì)菌表面展示系統(tǒng)中經(jīng)典的載體蛋白，是存在于熒光假單胞菌、假單胞桿菌、黃單胞菌屬和歐氏桿菌等細(xì)菌種屬中的一種分泌性型表面蛋白［9］. INP擁有可在-5～-2 ℃這樣相對(duì)高的溫度下形成質(zhì)地細(xì)膩、外形規(guī)則的微小異質(zhì)冰晶的能力［10］. 具有冰核蛋白冰核活性的細(xì)菌在冰核蛋白的作用下能使水分子按照一定的順序規(guī)則排列形成質(zhì)地細(xì)膩的冰晶核. 目前對(duì)于冰核蛋白的研究與應(yīng)用主要集中在促凍殺蟲(chóng)、植物保護(hù)、作物抗寒育種、食品工業(yè)以及人工降雪等領(lǐng)域［11-16］，但是目前冰核蛋白在人工造雪中應(yīng)用效果的研究報(bào)道并不多.

隨著全球氣候變暖導(dǎo)致的氣候極端性和不穩(wěn)定性上升，導(dǎo)致北半球積雪面積呈下降趨勢(shì)［17］，全球許多冬季旅游勝地都因?yàn)榻笛┝可倩颦h(huán)境溫度過(guò)高而出現(xiàn)了少冰缺雪的現(xiàn)象. 人為添加冰核蛋白作為晶核的人工造雪技術(shù)，可以在0 ℃左右成雪，且雪粒間不會(huì)相互粘連，物理抗擊性能好，成雪密度和含水量更易滿(mǎn)足滑雪場(chǎng)的造雪需要［18］. 而且可以提高水的利用率，有效節(jié)約水資源并保護(hù)水環(huán)境［19］. 因此，冰核蛋白在制造冰雪技術(shù)方面具有重大的推廣價(jià)值［20］. 但是，目前商用生物冰核劑造價(jià)高，不利于國(guó)內(nèi)需求量大的滑雪場(chǎng)大規(guī)模使用. 篩選優(yōu)化出適于在我國(guó)冰雪產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用的新的冰核蛋白劑，對(duì)于我國(guó)在冰雪產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域擁有節(jié)水型人工冰雪制劑和相關(guān)產(chǎn)品的自主研發(fā)權(quán)，爭(zhēng)取逐步脫離進(jìn)口做到自給自足，從而推動(dòng)我國(guó)在冰雪產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展具有重要的意義.

1 實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.1 菌種來(lái)源與保存

本研究所用的冰核蛋白原液由中科院微生物研究所提供.

菌種優(yōu)化過(guò)程：以Pantoea ananatis基因組DNA 為模板，以XhoI 和BglⅡ?yàn)橐?，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增冰核蛋白（INP）基因，并插入到pYB1S的XhoI和BglⅡ位點(diǎn)，產(chǎn)生pYB1S-INP. 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BW25113 中，得到用于INP 表達(dá)的重組菌株BW/pYB1a-INP. 大腸桿菌BW/pYB1a-INP 菌株用LB 培養(yǎng)基，氨芐西林（50 μg）250 r/min，37 ℃培養(yǎng). 將過(guò)夜培養(yǎng)物接種到含有1%接種物的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM 培養(yǎng)基中，并在30 ℃振蕩培養(yǎng)16 h. 通過(guò)在8000×g 下離心10 min 來(lái)收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，用去離子水洗滌四次，然后懸浮在去離子水中以形成細(xì)胞懸浮液（OD600=10 OD/mL）并通過(guò)超聲裂解. 之后原液分裝并-20 ℃冷凍保存，本實(shí)驗(yàn)中所使用的冰核蛋白原液的初始質(zhì)量濃度為0.23 mg/mL.

1.2 不同濃度冰核蛋白溶液的制備

每次實(shí)驗(yàn)前先將原液樣品冰上解凍后和水混合進(jìn)行稀釋?zhuān)鈨龊蟮谋说鞍自河米詠?lái)水混合稀釋分別稀釋10 倍、100 倍、500 倍、1000 倍、2000 倍和5000 倍，即分別得到質(zhì)量濃度為2.3×10-2、2.3×10-3、4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 的冰核蛋白溶液. 在實(shí)驗(yàn)中，相同體積的自來(lái)水樣本作為空白對(duì)照組.

預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)直接使用自來(lái)水水溫較高，降溫至各組實(shí)驗(yàn)溫度所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以本實(shí)驗(yàn)全部采用提前準(zhǔn)備好的4 ℃自來(lái)水制備溶液，這也更加接近冬季用水的實(shí)際情況.

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)中使用的冰核蛋白混合溶液體積有100 mL和1000 mL兩種.

凍結(jié)實(shí)驗(yàn)在焓差室中進(jìn)行，具體步驟為：①調(diào)整焓差室溫度，實(shí)驗(yàn)溫度分別為-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃，控制環(huán)境溫度誤差為±0.5 ℃. ②在室溫下迅速稀釋好的不同濃度的混合溶液后快速放置到焓差室中后，記錄時(shí)間和環(huán)境溫濕度，每隔5 min人工觀(guān)察燒杯中溶液凍結(jié)的變化，全程利用攝像機(jī)做好過(guò)程記錄. ③待所有燒杯中的溶液表面均凍結(jié)后，實(shí)驗(yàn)結(jié)束. 每次凍結(jié)實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察時(shí)間為120 min，如果120 min內(nèi)未能夠凍結(jié)，記錄為“未凍結(jié)”.

消融實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室常溫條件下進(jìn)行，觀(guān)察消融的過(guò)程并隨時(shí)記錄觀(guān)察到的現(xiàn)象和變化.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 -5 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-5 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)進(jìn)行了2次實(shí)驗(yàn)，第一次實(shí)驗(yàn)溶液的體積為100 mL，第二次實(shí)驗(yàn)溶液的體積為1000 mL. 具體結(jié)果參見(jiàn)表1.

表1 -5 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時(shí)間Tab.1 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-5 ℃

第一次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)添加冰核蛋白確實(shí)加快了溶液凍結(jié)的速度；而且從總的趨勢(shì)來(lái)看，添加冰核蛋白溶液濃度越高，溶液凍結(jié)的速度越快. 但是添加冰核蛋白的質(zhì)量濃度大于4.6×10-4mg/mL時(shí)，提高核微生物溶液濃度，溶液凍結(jié)的速度變化很小，而且添加的冰核蛋白溶液濃度過(guò)高會(huì)造成溶液的透明度低，從而導(dǎo)致最后成冰的透明度不夠好；同時(shí)最終成冰會(huì)伴隨較多的氣泡，且不如濃度低的溶液產(chǎn)生的冰堅(jiān)實(shí). 所以，從增加濃度與提高凍結(jié)速度的成本、效益以及成冰質(zhì)量綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)只用質(zhì)量濃度為4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL的溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

第二次實(shí)驗(yàn)每組實(shí)驗(yàn)所使用各濃度溶液的體積由100 mL 增加為1000 mL，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果與前兩組實(shí)驗(yàn)基本一致，結(jié)冰是從溶液表面開(kāi)始的，先有冰碴、逐漸形成冰層后才繼續(xù)向下延展；與空白溶液的凍結(jié)速度相比較，添加冰核蛋白可以加快凍結(jié)速度（圖1）. 由此可見(jiàn)，冰核蛋白用于大規(guī)模造雪、成冰是具有發(fā)展前景和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的.

圖1 不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)實(shí)驗(yàn)Fig.1 Freezing experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

2.2 -10 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-10 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)同樣進(jìn)行了兩次實(shí)驗(yàn)，第一次實(shí)驗(yàn)所使用不同濃度溶液的體積為100 mL，第二次實(shí)驗(yàn)每組實(shí)驗(yàn)所使用不同濃度溶液的體積為1000 mL. 具體結(jié)果參見(jiàn)表2.

表2 -10 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時(shí)間Tab.2 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-10 ℃

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：添加冰核蛋白快了溶液凍結(jié)的速度；低濃度溶液結(jié)冰后透明度更高，高濃度溶液結(jié)冰后會(huì)有較多氣泡. 在溶液凍結(jié)速度接近的情況下，4.6×10-4mg/mL 的溶液中生成的冰與其他質(zhì)量濃度的溶液相比，雖然溶液凍結(jié)的速度較快，但是透明度與硬度相對(duì)會(huì)差一些. 相對(duì)于其他質(zhì)量濃度溶液來(lái)講，4.6×10-5mg/mL 的溶液和空白組生成的冰層硬度更高也更透明，但是4.6×10-5mg/mL的溶液比4.6×10-4mg/mL的溶液結(jié)冰速度慢. 兼顧冰的質(zhì)量與結(jié)冰所需時(shí)間，1.15×10-4mg/mL的溶液凍結(jié)速度更為適宜，此濃度可能是效果最佳的. 但是-10 ℃環(huán)境溫度實(shí)驗(yàn)的效果沒(méi)有-5 ℃環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)明顯. 而在相同實(shí)驗(yàn)條件下，不同實(shí)驗(yàn)溶液體積實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，體積1000 mL 的溶液凍結(jié)實(shí)驗(yàn)中所用凍結(jié)時(shí)間小于100 mL溶液凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，這是由于隨著實(shí)驗(yàn)溶液體積增大，實(shí)驗(yàn)所用器皿變大，因此，實(shí)驗(yàn)溶液與環(huán)境接觸面積增大，散熱面積增加的緣故.

2.3 -15 ℃不同濃度冰核蛋白溶液凍結(jié)速度的比較

-15 ℃的環(huán)境溫度下在焓差室內(nèi)進(jìn)行了一次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所使用的溶液體積均為1000 mL. 實(shí)驗(yàn)具體結(jié)果參見(jiàn)表3.

表3 -15 ℃不同濃度冰核蛋白溶液的凍結(jié)時(shí)間Tab.3 Freezing times of ice nucleoprotein solutions with different concentrations at-15 ℃

通過(guò)-5 ℃、-10 ℃和-15 ℃三個(gè)不同環(huán)境溫度下溶液凍結(jié)速度與成冰效果的實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析，可以看出，溫度越低冰核蛋白對(duì)成冰速度的影響越小，而在-5 ℃時(shí)，添加冰核蛋白對(duì)成冰速度的提高影響較為顯著. 因此，在-5 ℃這樣相對(duì)高的溫度下添加冰核蛋白確實(shí)有利于增加溶液凍結(jié)的速度.

2.4 消融實(shí)驗(yàn)

為了能夠更直觀(guān)地觀(guān)察不同濃度冰核蛋白對(duì)冰消融的速度的影響，取體積為1000 mL，凍結(jié)溫度-5、-10 ℃，冰核蛋白溶液質(zhì)量濃度為4.6×10-4、2.3×10-4、1.15×10-4、4.6×10-5mg/mL 以及空白對(duì)照組樣品放入冰箱內(nèi)完全結(jié)冰，取出后在18 ℃的室溫環(huán)境下進(jìn)行消融實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 不同稀釋濃度溶液的消融開(kāi)始發(fā)生消融時(shí)間Tab.4 Onset time of ablation for solutions with different dilution concentrations

-5 ℃下凍結(jié)樣品消融實(shí)驗(yàn)中：14 min 時(shí)空白樣品杯壁處消融，樣品中心已經(jīng)有氣泡，冰能夠活動(dòng)；19 min時(shí)4.6×10-5、1.15×10-4、2.3×10-4mg/mL 的樣品燒杯底部有消融，其中，4.6×10-5mg/mL 的樣品最明顯；27 min時(shí)4.6×10-5mg/mL 的樣品已經(jīng)能在燒杯中活動(dòng)；32 min時(shí)1.15×10-4mg/mL 的樣品也能活動(dòng)，2.3×10-4mg/mL 的樣品變得更透明、杯壁處消融但不能活動(dòng).

-10 ℃下凍結(jié)樣品消融實(shí)驗(yàn)中：19 min時(shí)空白樣品的燒杯底部有消融；27 min時(shí)4.6×10-5mg/mL的樣品開(kāi)始消融滴水；32 min時(shí)2.3×10-4、1.15×10-4mg/mL的樣品變得透明度變高、杯壁處開(kāi)始消融；50 min時(shí)4.6×10-4mg/mL樣品中不斷有水滴滴下來(lái)，但是速度緩慢；62 min時(shí)所有樣品都開(kāi)始加速消融，其中空白樣品的消融速度最快.

通過(guò)消融實(shí)驗(yàn)（圖2）發(fā)現(xiàn)：添加冰核蛋白后能夠有效減緩消融的速度，使冰保持的時(shí)間更長(zhǎng)，且冰核蛋白溶液質(zhì)量濃度最高的4.6×10-4mg/mL 樣品消融速度最慢.

圖2 不同濃度冰核蛋白溶液消融實(shí)驗(yàn)Fig.2 Ablation experiments of ice nucleoprotein solutions with different concentrations

3 結(jié)論

通過(guò)添加不同濃度冰核蛋白之后溶液凍結(jié)以及消融速度的實(shí)驗(yàn)對(duì)比得出如下結(jié)論：

1）本研究的冰核蛋白由于其成冰核活性能夠影響冰的凍結(jié)過(guò)程和消融過(guò)程，相比不添加冰核蛋白的空白對(duì)照組，添加冰核蛋白的實(shí)驗(yàn)組能夠加快溶液凍結(jié)的速度，也能延長(zhǎng)溶液凍結(jié)的時(shí)間.

2）在一定添加濃度的范圍內(nèi)，添加的冰核蛋白濃度越低，成冰的透明度越高.

3）添加不同濃度冰核蛋白的效果在環(huán)境溫度較高的情況下較為明顯，當(dāng)環(huán)境溫度過(guò)低時(shí)，添加冰核蛋白作用對(duì)溶液凍結(jié)速度的影響不明顯.

綜上，利用本種冰核蛋白作為晶核能夠影響溶液成冰的速度和質(zhì)量，也能夠有效減緩冰消融的速度并提高冰保存的時(shí)長(zhǎng). 從冰的凍結(jié)速度、透明度和堅(jiān)實(shí)程度綜合考慮，添加質(zhì)量濃度為1.15×10-4mg/mL（即稀釋2000倍）的冰核蛋白作為冰晶核可以有效提升水—冰相變的效率，如應(yīng)用于人工造雪技術(shù)，在冬季早晚典型的邊際天氣條件下可以更加有效提高人工造雪的效率.