易希善，康學(xué)東，楊維杰，柏婷燕，肖國(guó)慶

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(甘肅 蘭州 730000) 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(甘肅 蘭州 730000)

甲狀腺結(jié)節(jié)是一個(gè)或多個(gè)甲狀腺組織結(jié)構(gòu)異常所引起的疾病，是內(nèi)分泌最常見(jiàn)的疾病之一，約5%的人存在可觸及的結(jié)節(jié)，70%的人偶然行B超檢查發(fā)現(xiàn)，在老年患者中患病率逐漸增加[1]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，臨床多見(jiàn)無(wú)痛性甲狀腺結(jié)節(jié)，大多數(shù)為良性，約5%為惡性[2]。甲狀腺結(jié)節(jié)在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)歸為“癭病”，其病因?yàn)闅馓叼霪B交為患，治療在去除病因的同時(shí)當(dāng)消腫散結(jié)[3]。夏枯草為唇形科夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，功用有清肝散結(jié)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)藥理研究指出[4-9]，夏枯草在抗炎、抗病毒、清除自由基、抗腫瘤等方面起著獨(dú)特作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)和計(jì)算生物學(xué)相結(jié)合的新興學(xué)科，用來(lái)研究多組分和多靶點(diǎn)的制劑[10]。傳統(tǒng)中藥夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)有廣泛使用和確定療效，盡管其有效成分已被研究鑒定，然而，治療甲狀腺結(jié)節(jié)的科學(xué)原理和機(jī)制在很大程度上仍未被探索。本研究以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為工具，剖析了夏枯草藥物治療良性甲狀腺結(jié)節(jié)病的潛在有效機(jī)制，從而為夏枯草藥物治療甲狀腺結(jié)節(jié)的臨床研究尋找理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1有效成分和靶蛋白的篩選夏枯草的活性成分及其相應(yīng)靶蛋白取自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)。藥物活性成分擁有的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)如OB(Oral Bioavailability)和DL(Drug-Likeness)。在TCMSP獲取活性成分靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)，然后用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將得到的靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因文件。為體現(xiàn)有效成分的藥理活性，本研究將OB≥30%和DL≥0.18設(shè)定為篩選臨床藥物的標(biāo)準(zhǔn)[11-13]。

1.2甲狀腺結(jié)節(jié)基因靶點(diǎn)的獲取甲狀腺結(jié)節(jié)的基因靶點(diǎn)取自于GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)。在兩數(shù)據(jù)庫(kù)檢索框中輸入“Thyroid nodules”，獲取疾病基因靶點(diǎn)，利用R語(yǔ)言將兩數(shù)據(jù)庫(kù)中的疾病基因靶點(diǎn)合并去重，經(jīng)過(guò)整理，獲取到了夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的有效作用靶點(diǎn)。

1.3“藥物-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建整合藥物、化合物、基因、疾病有關(guān)的信息。在Cytoscape軟件(Version 3.7.0)中獲得“藥物-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)。將獲得的數(shù)據(jù)充分利用并分析以觀察夏枯草活性成分與甲狀腺結(jié)節(jié)基因靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，以便于獲取關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將上述得到的關(guān)鍵蛋白和基因引入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.string-db.org/Version:11.0)，獲取到夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI network)，在此網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)的自由度—degree值大小代表相關(guān)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性。

1.5GO富集分析與KEGG通路分析將上述結(jié)果引入David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)實(shí)行GO(gene ontology)分析與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析。將富集得到的所有結(jié)果均以P<0.05作為臨界標(biāo)準(zhǔn)[14]。

1.6夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證靶點(diǎn)與化合物的相互作用。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取并下載化合物3D結(jié)構(gòu)文件，然后利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)下載靶點(diǎn)文件。最后利用AUTODOCK(Version 1.5.6)軟件對(duì)相關(guān)分子去水、加氫等，獲得分子對(duì)接結(jié)果。將獲得分子對(duì)接的PDBQT文件，用Open Babel Gui(Version 2.4.1)軟件轉(zhuǎn)為PDB文件，以便后續(xù)進(jìn)行分子對(duì)接圖制作。最后用PYMOL(Version 2.3.0)軟件將獲得的PDB文件進(jìn)行對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1夏枯草有效成分和作用靶點(diǎn)的篩選在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索有效成分，最終得到有效成分11個(gè)，見(jiàn)表1。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢這些有效成分的作用靶標(biāo)，結(jié)果顯示11個(gè)有效成分作用于97個(gè)有效且獨(dú)立的靶標(biāo)。通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因。

表1 夏枯草的有效成分

2.2甲狀腺結(jié)節(jié)已知靶點(diǎn)的搜集從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到了2 709個(gè)甲狀腺結(jié)節(jié)治療靶點(diǎn)，從OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜集了甲狀腺結(jié)節(jié)治療靶點(diǎn)227個(gè)，合并去重后共得到2 793個(gè)治療靶點(diǎn)，最終分析得到重疊基因，見(jiàn)圖1。

圖1 夏枯草與甲狀腺結(jié)節(jié)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)venny圖

2.3“藥物-化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在上述的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中得到了夏枯草有效成分的靶基因和甲狀腺結(jié)節(jié)的治療靶基因，經(jīng)過(guò)充分整合有關(guān)信息，通過(guò)Cytoscape軟件構(gòu)筑“藥物-化合物-疾病-基因”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。所得到的網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)80個(gè)，其中68個(gè)節(jié)點(diǎn)代表基因靶點(diǎn)(藍(lán)色橢圓)，10個(gè)節(jié)點(diǎn)代表有效成分(粉紅色八邊形)，1個(gè)節(jié)點(diǎn)代表藥物(紫色矩形)，剩下的1個(gè)節(jié)點(diǎn)代表疾病(黃色菱形)。網(wǎng)絡(luò)總相互作用關(guān)系412個(gè)，各節(jié)點(diǎn)之間的連線代表相互作用關(guān)系，節(jié)點(diǎn)連線越多代表該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越關(guān)鍵。通過(guò)Cytoscape軟件可以清楚地了解夏枯草有效成分的degree值，該值表示相關(guān)成分起到的作用性大小，實(shí)驗(yàn)獲取到了槲皮素、木犀草素、山奈酚等有效活性成分為夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的關(guān)鍵作用成分，見(jiàn)表2。

圖2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

表2 夏枯草有效成分Degree值

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將相關(guān)信息上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以構(gòu)筑PPI網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。得到的網(wǎng)絡(luò)擁有68個(gè)節(jié)點(diǎn)(網(wǎng)絡(luò)中由于1個(gè)節(jié)點(diǎn)與周圍節(jié)點(diǎn)無(wú)連線，故圖中已隱藏)和1 242條作用關(guān)系。文中篩除了degree值排序前20后的蛋白，見(jiàn)圖4。預(yù)測(cè)這些靶點(diǎn)可能是夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的核心靶蛋白。

圖3 夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 “藥物-疾病”相關(guān)靶點(diǎn)基因鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目柱形圖

2.5靶點(diǎn)富集分析利用GO富集分析和KEGG對(duì)基因結(jié)合性分析，在DAVID平臺(tái)中，以篩選出前20個(gè)生物學(xué)過(guò)程。最終GO結(jié)果見(jiàn)圖5，P值越高代表富集顯著，橫坐標(biāo)反映富集基因比率，在此研究結(jié)果中，相關(guān)成分與基因作用的生物功能主要涉及RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II-specific DNA-binding transcription factor binding)、凋亡域結(jié)合(death domain binding)、激酶調(diào)節(jié)活性(kinase regulator activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、核受體活性(nuclear receptor activity)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性，RNA聚合酶II特異性(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific)、蛋白質(zhì)異二聚化活性(protein heterodimerization activity)、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)等共96個(gè)生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路分析結(jié)果顯示117個(gè)信號(hào)通路涉及MAPK(hsa04010)、PI3K-Akt(hsa04151)、TNF(hsa04668)、化學(xué)致癌-受體激活(hsa05207)等。其中，化學(xué)致癌-受體激活(hsa05207)生物學(xué)過(guò)程基因富集程度最高，見(jiàn)圖6。從中可以看到，一個(gè)通路包含多個(gè)蛋白質(zhì)，同時(shí)，一個(gè)蛋白質(zhì)也可參與多個(gè)通路，夏枯草中的活性成分可能通過(guò)這些通路治療包括甲狀腺結(jié)節(jié)在內(nèi)的一些疾病。

圖5 GO富集條目柱形圖

圖6 KEGG富集氣泡圖

2.6分子對(duì)接結(jié)果分析將上述獲得的3個(gè)關(guān)鍵成分Quercetin、Luteolin、Kaempferol分別與5個(gè)關(guān)鍵蛋白IL-6、VEGFA、CASP3、EGFR、MAPK8進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)接結(jié)合能小于-5.0說(shuō)明關(guān)鍵成分與靶蛋白有很好的結(jié)合力[15]。MAPK8與Luteolin的5個(gè)氨基酸殘基(MET-218、MET-121、VAL-278、ALA-282、LEU-123)相互作用(圖7a)，而與Kaempferol的4個(gè)氨基酸殘基(MET-218、GLN-120、LEU-123、VAL-278)有相互作用(圖7b)；而IL-6基因和Kaempferol成分的3個(gè)氨基酸殘基(LEU-62、LEU-64、GLU-172)相互作用(圖7c)。分子對(duì)接結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵蛋白能穩(wěn)定結(jié)合。

表3 關(guān)鍵蛋白與相關(guān)成分對(duì)接結(jié)果(kcal/mol)

注：a：MAPK8與Kaempferol分子對(duì)接 b：MAPK8與Luteolin分子對(duì)接 c：IL-6與Kaempferol分子對(duì)接。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥研究中，用來(lái)探索潛在的治療靶點(diǎn)和藥理機(jī)制[16]。本次結(jié)果顯示，總共得到68個(gè)靶點(diǎn)基因和11個(gè)有效活性成分，在這11個(gè)有效成分中，槲皮素已被證實(shí)有抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化及清除自由基的作用[17]。然而，在治療甲狀腺亢進(jìn)方面，槲皮素也參與其中，早期的研究表明，當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)抗甲狀腺藥物丙硫氧嘧啶(PTU)的相對(duì)功效進(jìn)行比較時(shí)，番荔枝籽提取物中的槲皮素參與調(diào)節(jié)甲狀腺活性，表明它們?cè)谡{(diào)節(jié)甲狀腺功能亢進(jìn)方面的潛力，而這與甲狀腺結(jié)節(jié)的治療也有相似之處[18]。木犀草素作為一種常見(jiàn)的植物化學(xué)物質(zhì)，在異常細(xì)胞增殖和腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用[19]。相關(guān)疾病治療方面，這種作用也可能是其治療甲狀腺結(jié)節(jié)的有效機(jī)制。山奈酚(4’,5,7-三羥黃酮醇)在現(xiàn)代藥理研究中還具有抗炎、抗腫瘤以及抗氧化等作用[20]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明山奈酚在抗細(xì)胞增殖與microRNA蛋白有諸多聯(lián)系，并且涉及p-AKT在內(nèi)的多種信號(hào)通路[21]。

從“藥物-成分-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中可以看出，這些活性成分具有共同的靶點(diǎn)，說(shuō)明在針對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)方面這些成分是有一定協(xié)同作用。PPARG基因作為夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)之一，其可被夏枯草中的4種化合物所利用。PPARG基因被認(rèn)為是甲狀腺濾泡過(guò)度增殖最重要的易感基因之一[22]。表明不同的中藥活性成分可以作用同一個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)山奈酚可作用于24個(gè)靶點(diǎn)，說(shuō)明單一活性成分也可作用于多個(gè)基因。

夏枯草干預(yù)甲狀腺結(jié)節(jié)的核心靶點(diǎn)有IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子a(VEGFa)、胱天蛋白酶3(CASP3)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)等，根據(jù)獲得的GO富集結(jié)果，這些靶點(diǎn)可能通過(guò)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、乏素蛋白連接酶結(jié)合等影響凋亡通路分子水平調(diào)控甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)生。IL-6作為一種多效性細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥、腫瘤等方面有多種功能[23]。關(guān)于IL-6的“反式信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”，IL-6/sIL-6R復(fù)合物與gp130結(jié)合并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。而在幾種慢些炎癥和癌癥中也報(bào)道了高水平的IL-6/sIL-6R[24]。IL-6升高促進(jìn)CD4、CD8細(xì)胞毒性，影響CD4+T細(xì)胞對(duì)甲狀腺組織的抵抗作用，而此炎癥因子與TSH及TRAb的表達(dá)均有顯著關(guān)系，這也成為甲狀腺結(jié)節(jié)的潛在治療機(jī)制[25]。VEGFA來(lái)源于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族，其最初被證明為一種內(nèi)皮生長(zhǎng)因子合調(diào)節(jié)血管通透性因子[26]。但隨著研究的深入，其也被證實(shí)是內(nèi)臟生長(zhǎng)過(guò)程中血管生成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子[27]。研究指出[28]，MAPK通路中VEGFA基因多態(tài)性有很大的可能性與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫有關(guān)。在VEGFA基因rs3025040位點(diǎn)T→C的突變是結(jié)節(jié)性甲狀腺腫疾病的潛在危險(xiǎn)因素。但是VEGFA基因rs3024997位點(diǎn)AG基因型T→C突變則有很大可能是結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的相關(guān)保護(hù)因素。CASP3基因，又稱胱天蛋白酶3，可專一性的刪減編排多聚ADP核糖聚合酶-PARP1、乙?；?DEVD-7-氨基-4-甲基香豆素(Ac-DEVD-AMC)，使DNA裂化從而引起細(xì)胞凋亡[29]。研究顯示[30]橋本甲狀腺炎凋亡組織周圍伴有CASP3的高表達(dá)，而相關(guān)遠(yuǎn)離的組織則無(wú)表達(dá)，相關(guān)TUNEL檢測(cè)證明,淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域凋亡細(xì)胞會(huì)成簇出現(xiàn)，同時(shí)伴有附近濾泡結(jié)構(gòu)的破壞，這足以說(shuō)明甲狀腺濾泡的破壞與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，CASP3的表達(dá)則對(duì)周圍甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，使其凋亡。EGFR基因作為糖蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子(HER)家族成員之一，相關(guān)研究指出[31]在抑制細(xì)胞增殖、血管生成和凋亡有關(guān)的途徑中存在著它的高表達(dá)，尤其是在腫瘤組織中。EGFR影響腫瘤血管生成的方式是調(diào)節(jié)人血管生成素-1(Ang-1)和VEGF的水平。VEGF因子多態(tài)性也與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫高度相關(guān)[28]。分子對(duì)接結(jié)果也顯示，夏枯草關(guān)鍵成分與IL-6、MAPK8、VEGFA等親和力高，有較高的藥理活性。這些研究及發(fā)現(xiàn)提示，夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)在IL-6、MAPK8、VEGFA等因子的介入下，與細(xì)胞凋亡的生物過(guò)程密切相關(guān)。

本研究篩選的信號(hào)通路中，與甲狀腺結(jié)節(jié)關(guān)聯(lián)度高的有MAPK通路、PI3K-Akt通路、TNF通路等，這表明夏枯草的多種有效成分通過(guò)多種途徑治療甲狀腺結(jié)節(jié)。如PI3K-Akt，相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)PI3K具有磷酸?；〈技っ负徒z氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性，經(jīng)上游激活后的一段時(shí)間，PI3K磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)為三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)[32]，AKT為其下游中的一個(gè)重要蛋白，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。然而在相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中，PIP3和AKT氨基末端PH獨(dú)立結(jié)構(gòu)相結(jié)合，從而將AKT募集至細(xì)胞質(zhì)膜上被PDKI—3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和m TORC2(蛋白復(fù)合物酶)激活，Thr308位點(diǎn)和Ser473相關(guān)位點(diǎn)磷酸化，用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活[33]。國(guó)外研究證明了甲狀腺結(jié)節(jié)病的發(fā)生過(guò)程伴著PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，而在甲狀腺結(jié)節(jié)的整個(gè)疾病過(guò)程中，PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)中相關(guān)分子的激活與甲狀腺結(jié)節(jié)病的良惡性有關(guān)，而這與PI3KmRNA、AktmRNA及PI3K、Akt、pAkt蛋白等蛋白的顯著升高有關(guān)[34]。所以，可以確定夏枯草通過(guò)調(diào)控MAPK，PI3K-Akt等相關(guān)通路而達(dá)到對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的治療作用。

由于中藥成分的復(fù)雜性，當(dāng)前還未有夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)的有效成分和靶點(diǎn)與相關(guān)作用機(jī)制的研究。這項(xiàng)研究說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥相關(guān)成分及其作用機(jī)制的研討具有重要意義。然而，甲狀腺結(jié)節(jié)的發(fā)病機(jī)制也并非單一的，信號(hào)通路兩兩相互交叉調(diào)節(jié)，呈現(xiàn)多通路和多靶點(diǎn)的作用模式。藥物與疾病之間是有量效關(guān)系的，但是目前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究很難達(dá)到量化的目的。本研究在探究其作用機(jī)制的同時(shí)，能對(duì)臨床治療甲狀腺結(jié)節(jié)提供相關(guān)理論依據(jù)，也為全面了解夏枯草治療甲狀腺結(jié)節(jié)提供另一種策略。