李江姣，劉茹鳳，李康，黃洋，徐瀟，石繼春，王春娥，梁麗，陳馳，葉強(qiáng)

·技術(shù)與方法·

腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品的研制

李江姣*，劉茹鳳*，李康，黃洋，徐瀟，石繼春，王春娥，梁麗，陳馳，葉強(qiáng)

腦膜炎奈瑟菌（，Nm），又名腦膜炎雙球菌或腦脊髓膜炎雙球菌，是一種革蘭氏陰性菌，根據(jù)莢膜多糖可分為 A、B、C、D、X、Y、Z、29E、W135、L、H、I、K 等 13 個(gè)血清群，主要寄居在人體鼻咽部，可通過飛沫傳播。人感染腦膜炎奈瑟菌可引起敗血癥或流行性腦脊髓膜炎（簡(jiǎn)稱流腦）等急性呼吸道傳染病，常伴隨著較高的死亡率[1-3]。建立高效的 Nm 檢測(cè)方法對(duì)流腦的臨床診斷有重要的意義。

流腦的常規(guī)診斷方法是從腦脊液和血液中分離出病原菌，而傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，Nm 易在標(biāo)本運(yùn)輸過程中死亡，當(dāng)患者接受抗菌藥物治療以及受其他非特異性因素的影響時(shí)，會(huì)引起細(xì)菌分離的失敗，降低細(xì)菌培養(yǎng)法的準(zhǔn)確性，因此采用敏感性更高的檢測(cè)方法變得十分重要。近年來，核酸檢測(cè)技術(shù)因其快速、靈敏等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。利用核酸檢測(cè)技術(shù)檢測(cè) Nm 的敏感性和特異性高，經(jīng)濟(jì)成本低，為 Nm 的檢測(cè)提供了重要的技術(shù)手段[4-6]。因各種檢測(cè)試劑的取樣量及選取的目的基因片段不同，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及靈敏度等存在差異。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的國(guó)家參考品，使得該類檢測(cè)試劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)成為難題。本研究擬研制一套腦膜炎奈瑟菌國(guó)家參考品，提升對(duì)腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血紅蛋白粉均購自美國(guó) BD 公司；中國(guó)細(xì)菌濁度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑盒 A（批號(hào)：20200501）、試劑盒 B（批號(hào)：P20200701）和試劑盒 C（批號(hào)：20200601）分別來自 3 家腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)企業(yè)；培養(yǎng)箱 5810E 購自美國(guó) Nuaire 公司；ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀購自美國(guó) ABI 公司。

1.1.2 菌株 10 株陽性參考品菌株腦膜炎奈瑟菌均來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，編號(hào)分別為：CMCC(B)29015、CMCC(B)29016、CMCC(B)29031、CMCC(B)29050、CMCC(B)29051、CMCC(B)29052、CMCC(B)29055、CMCC(B)29043、CMCC(B)29046、CMCC(B)29028；10 株陰性參考品菌株也來源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，分別為：流感嗜血桿菌 CMCC(B)58561、肺炎克雷伯 CMCC(B)46117、銅綠假單胞菌 CMCC(B)10104、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26001、肺炎鏈球菌 CMCC(B)31001、A 族鏈球菌 CMCC(B)32067、白喉棒桿菌 CMCC(B)38102、卡他布朗漢姆氏菌 CMCC(B)29118、百日咳 CMCC(B)58039、大腸桿菌 CMCC(B)44113。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將各菌株接種于適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上，于最適溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。取新鮮的固體培養(yǎng)物或液體培養(yǎng)物沉淀，用無菌生理鹽水重懸制成菌懸液，采用比濁法或平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定濃度，采用適宜溫度進(jìn)行熱滅活，并對(duì)滅活效果進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 參考品制備

1.2.2.1 陽性參考品 將 10 株腦膜炎奈瑟菌原菌液稀釋至 1 × 106個(gè)/ml，定量分裝，0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，標(biāo)記為 P1 ～ P10。

1.2.2.2 陰性參考品 流感嗜血桿菌原菌液稀釋至1 × 106個(gè)/ml，其余 9 株陰性參考品原菌液稀釋至 1 × 107個(gè)/ml，定量分裝 0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，標(biāo)記為 N1 ～ N10。

1.2.2.3 重復(fù)性參考品和最低檢出限參考品 將腦膜炎奈瑟菌原菌液（CMCC 29052）稀釋至 1 × 106個(gè)/ml，定量分裝，0.8 ml/管，–20 ℃以下保存，分別標(biāo)記為 R 和 S。

1.2.3 均勻性檢測(cè) 隨機(jī)抽取陽性參考品、最低檢出限參考品各 10 支，重復(fù)性參考品 15 支，用腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑盒 B 進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算 Ct 值的 CV 值。

1.2.4 穩(wěn)定性檢測(cè) 將陽性參考品、精密性參考品、最低檢出限參考品分別于2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7 和 14 d，反復(fù)凍融 3 次、5 次，以–20 ℃冰箱中保存的參考品作為對(duì)照，用試劑盒 A 進(jìn)行檢測(cè)，考察參考品于不同溫度下放置不同時(shí)間及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性。

1.2.5 參考品驗(yàn)證

1.2.5.1 準(zhǔn)確性驗(yàn)證 將陽性參考品分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行 10 倍稀釋，標(biāo)記為 P1 ～ P10，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè) 2 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行 2 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 特異性驗(yàn)證 將陰性參考品分別用滅菌生理鹽水 10 倍稀釋，標(biāo)記為N1 ～ N10，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè) 2 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行 2 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.3 重復(fù)性驗(yàn)證 將重復(fù)性參考品（10 支）分別用滅菌生理鹽水 10 倍稀釋，標(biāo)記為 R，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本平行檢測(cè) 2 次，重復(fù)檢測(cè) 10 次。每個(gè)試劑盒進(jìn)行 2 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.4 最低檢出限驗(yàn)證 取最低檢出限參考品（1 ×106個(gè)/ml），用滅菌生理鹽水進(jìn)行系列稀釋，檢測(cè)試劑盒 A、B、C 的最低檢出限。

2 結(jié)果

2.1 參考品的分裝均勻性評(píng)估

試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，各陽性參考品、最低檢出限參考品 Ct 值的 CV（n = 10）、重復(fù)性參考品 Ct 值的 CV（n = 15）均在 5.0% 以內(nèi)，說明參考品的分裝均勻度良好。

2.2 參考品的穩(wěn)定性評(píng)估

2.2.1 凍融穩(wěn)定性評(píng)估 經(jīng)反復(fù)凍融 3、5 次處理后，與–20 ℃保存對(duì)照參考相比，Ct 值變化不大，表明本參考品具有較好的凍融穩(wěn)定性（圖1）。

表1 參考品分裝均勻性評(píng)估

樣品CtSDCV（%） P126.290.240.93 P225.100.351.39 P326.380.230.86 P428.050.321.14 P525.100.250.98 P623.530.301.27 P724.750.150.59 P824.190.291.18 P925.810.773.00 P1025.010.311.23 S25.450.150.58 R25.650.210.81

2.2.2 加速穩(wěn)定性評(píng)估 將參考品分別于 2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7、14 d 后，與–20 ℃保存對(duì)照參考相比，Ct 值變化不大，表明本參考品具有較好的加速穩(wěn)定性，可以滿足運(yùn)輸、使用等的穩(wěn)定性要求（圖2）。

2.3 參考品的適用性驗(yàn)證

采用 3 家企業(yè)的試劑盒對(duì)制備參考品進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，各試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性及重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果均符合要求。試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 的陽性參考品符合率均為 10/10；陰性參考品符合率均為 10/10；重復(fù)性參考品 10 次檢測(cè)的 Ct 值的 CV 值均小于 5%。試劑盒 A和 B 的最低檢出限為 1.0 × 103個(gè)/ml，試劑盒 C 的最低檢出限為 1.0 × 104個(gè)/ml（表2）。

圖1 凍融穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果（1 × 104和 1 × 103分別表示將最低檢出限參考品稀釋為 1 × 104個(gè)/ml 和 1 × 103個(gè)/ml）

圖2 加速穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果（1 × 104和 1 × 103分別表示將最低檢出限參考品稀釋為 1 × 104個(gè)/ml 和 1 × 103個(gè)/ml）

表2 參考品適用性檢測(cè)

試劑盒P1 ～ P10N1 ～ N10CV（%）1.0 × 104（個(gè)/ml）1.0 × 103（個(gè)/ml）1.0 × 102（個(gè)/ml） A10/1010/101.49++- B10/1010/100.70++- C10/1010/100.50+--

注：“+”表示檢出；“-”表示未檢出。

3 討論

核酸診斷試劑的質(zhì)量關(guān)乎病原體的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，而其質(zhì)量評(píng)價(jià)依賴于科學(xué)、公正的國(guó)家參考品[7]。因相關(guān)參考品的缺乏，本研究研制了腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品。在菌株篩選方面，從中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心選擇 10 種不同血清型的腦膜炎奈瑟菌作為 10 個(gè)陽性參考菌株，使各陽性菌株具有充分多樣性。陰性菌株在選擇時(shí)，充分考慮與腦膜炎奈瑟菌感染部位相同或感染癥狀相似的病原菌，以及一些常見的其他病原體，從而排除非腦膜炎奈瑟菌的干擾。

本研究建立的腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品由滅活菌懸液制成，一套參考品包括 10 個(gè)陽性參考品、10 個(gè)陰性參考品、1 個(gè)最低檢出限參考品和 3 個(gè)重復(fù)性參考品。參考品的均勻性檢測(cè)結(jié)果顯示，各陽性參考品、重復(fù)性參考品和最低檢出限參考品 Ct 值的 CV 均在 5.0% 以內(nèi)，說明參考品的分裝均勻度良好。穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明，參考品經(jīng)反復(fù)凍融 3、5 次處理，以及 2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7、14 d，具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足運(yùn)輸、使用等的穩(wěn)定性要求。使用 3 家企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒對(duì)參考品進(jìn)行適用性驗(yàn)證，結(jié)果表明其準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性均滿足要求，最低檢出限檢測(cè)結(jié)果顯示各企業(yè)試劑盒的最低檢出限存在差異。

綜上所述，本研究制備的腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，經(jīng)驗(yàn)證具有良好的準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性，能夠用于腦膜炎奈瑟菌核酸檢測(cè)試劑的質(zhì)量控制和性能評(píng)價(jià)。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.013

“十三五”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2018ZX10102-001-002、2018ZX09738006-006）；國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)——國(guó)家菌種資源庫課題（NMRC-2020-2）

102629 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心

葉強(qiáng)，Email：qiangyee@nifdc.org.cn

2021-09-27

*同為第一作者