崔玉晶，高佩，文娟，OKYERE Kumi Samuel，胡延春

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

紫莖澤蘭（Ageratina adenophora），是一種多年生菊科植物，原產(chǎn)于墨西哥和哥斯達(dá)黎加，現(xiàn)已入侵至歐洲、大洋洲和亞洲等地［1?2］，1940年從中緬邊境傳入云南［3］，現(xiàn)已廣泛傳播到四川、西藏等地，是我國最重要的入侵植物物種之一，對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展造成了極大的危害［4］。紫莖澤蘭對(duì)羊、大鼠、小鼠等多種動(dòng)物有很高的毒性，可造成不同動(dòng)物組織器官的毒性損傷和炎性反應(yīng)，研究已證實(shí)紫莖澤蘭可使動(dòng)物發(fā)生肝臟、脾臟等實(shí)質(zhì)臟器的損傷［5］，能夠通過氧化損傷、激活炎癥反應(yīng)損傷器官結(jié)構(gòu)與激活免疫應(yīng)答［6］，但目前仍無紫莖澤蘭對(duì)腸道影響的報(bào)道。因此本研究以SD 大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)采食紫莖澤蘭的大鼠腸道結(jié)構(gòu)及黏膜免疫的損傷進(jìn)行探究，旨在為紫莖澤蘭對(duì)動(dòng)物機(jī)體致毒性提供一定的參考與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備與飼養(yǎng)管理

紫莖澤蘭葉片于2019年7月采集自四川省西昌市，將葉片清洗后晾干，用CW700 研磨機(jī)研磨成粉末，再經(jīng)0.425 mm 網(wǎng)篩過篩后得到紫莖澤蘭草粉，將草粉存放于陰涼干燥處。標(biāo)準(zhǔn)大鼠粉末飼料購自成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼料制備參考自Kaushal 等［7］及本試驗(yàn)室前期試驗(yàn)［8?9］和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，即將紫莖澤蘭草粉與標(biāo)準(zhǔn)大鼠粉末飼料按3∶7 的比例加水混合均勻，制作成直徑1 cm 圓柱形顆粒狀飼料，60 ℃烘干，此為含有30%紫莖澤蘭草粉飼料，另按相同的方式用標(biāo)準(zhǔn)大鼠粉末飼料制作不含紫莖澤蘭草粉飼料。

試驗(yàn)使用16 只7 周齡雄性SD 大鼠，體重（200±25）g，采購自成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物有限公司［生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030；使用許可證號(hào)：SYXK（川）2014-187］，飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物房，維持飼養(yǎng)條件在室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，日夜光照12 h 交替。經(jīng)適應(yīng)性飼喂7 d 后將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組（n=8），對(duì)照組飼喂0%紫莖澤蘭草粉飼料（10 g·100 g?1BW），試驗(yàn)組飼喂30%紫莖澤蘭草粉飼料（10 g·100 g?1BW），自由飲水，飼養(yǎng)周期為14 d。

1.2 樣品采集

將各組大鼠禁食12 h，用乙醚充分麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，立即剖檢，分離腸系膜與脂肪組織，完整的取出腸道，放在盛有預(yù)冷PBS（phosphate buffered saline，PBS）平皿中采集各腸段：在距幽門2～3 cm 處采集十二指腸樣本，在空腸中段采集空腸樣本，在距回腸末端2～3 cm 處采集回腸樣本，在距盲腸盲端0.5 cm 處采集盲腸樣本，在距肛門8 cm 處采集結(jié)腸樣本，在距肛門1 cm 處采集直腸樣本，將各腸段樣本分為三部分，一部分無須沖洗直接放入10%多聚甲醛中，用于制備石蠟切片；一部分用4 ℃PBS 緩沖液洗去腸內(nèi)容物，用無菌紗布擦干準(zhǔn)確稱量0.1 g，制備為10%組織勻漿；最后一部分（約50 mg）迅速放入液氮中速凍，用以組織RNA 提取。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 HE 染色及組織病理學(xué)觀察 取制備好的石蠟切片按照制造商說明書進(jìn)行HE（hematoxylin-eosin staining，HE）染色（武漢塞維爾，G1001），用OLYMPUS 玻片掃描系統(tǒng)掃描HE 切片全片，儲(chǔ)存圖像備用，用OlyVIA 軟件將對(duì)照組與試驗(yàn)組各腸段圖像進(jìn)行比較，分析其病理變化。

1.3.2 組織學(xué)評(píng)分 參照Appleyard 等［10］的方法對(duì)各腸段進(jìn)行病理損傷組織學(xué)評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 病理損傷組織學(xué)評(píng)分Table 1 Criteria for histological scoring of damage

1.3.3 形態(tài)學(xué)測量 用OlyVIA 軟件查看HE 切片圖像，選取結(jié)構(gòu)層次清晰，均勻染色區(qū)域拍照，用Image Pro Plus 6.0 軟件測量小腸（十二指腸、空腸、回腸）的絨毛高度，隱窩深度。將絨毛尖端到絨毛隱窩交界處的距離記為絨毛高度，相鄰絨毛間的凹陷深度記為隱窩深度［11］，并根據(jù)上述測量結(jié)果計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。在每腸段3 個(gè)重復(fù)中各分析了10 個(gè)定向良好延展均勻的隱絨毛單位。

1.3.4 IELs 及LPLs 計(jì)數(shù) 用OlyVIA 軟件查看HE 切片圖像，選取結(jié)構(gòu)層次清晰、均勻染色區(qū)域拍照，觀察IELs 和LPLs 的分布與數(shù)量，約94%的上皮淋巴細(xì)胞位于小腸上皮基底部［12］，因此以黏膜上皮層為界，參照Moghaddam 計(jì)數(shù)方法［13］，每張小腸切片隨機(jī)選取5 根腸絨毛，每張大腸切片隨機(jī)選取5 個(gè)腸腺，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每1 根腸絨毛或每一個(gè)腸腺IELs（intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs）與LPLs（lamina propria lymphocytes，LPLs）的數(shù)量。

1.3.5 AB?PAS 染色及GCs 計(jì)數(shù) 取制備好的石蠟切片按照制造商說明書進(jìn)行AB?PAS 染色（武漢塞維爾，GP1049），用OLYMPUS 玻片掃描系統(tǒng)掃描全片，儲(chǔ)存圖像后用OlyVIA 軟件選取染色均勻的視野拍照，每張切片在200 下隨機(jī)選取5 個(gè)視野并拍照，各試驗(yàn)組與對(duì)照組需選取結(jié)構(gòu)相似區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)杯狀細(xì)胞（goblet cells，GCs）的數(shù)量。

1.3.6 qRT?PCR 檢測紫莖澤蘭對(duì)大鼠腸道黏膜細(xì)胞因子相關(guān)基因mRNA 的影響 采用Oligo 7.0軟件對(duì)IL-1β、IL-4、TNF-α、IFN-γ和β-actin基因進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，并由上海生工生物有限公司合成，引物序列如表2 所示，使用Bio-RAD 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（CFX96）對(duì)腸道黏膜中細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行定量分析，反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq（2×），10 μmol·L?1的上下游引物各0.4 μL，1 μL 樣品DNA 以及8.2 μL DEPC 水，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃5 min 后，95 ℃10 s，60 ℃下退火及延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.7 ELISA 檢測紫莖澤蘭對(duì)大鼠腸道黏膜細(xì)胞因子分泌量在蛋白水平的影響 將制備好的10%組織勻漿按ELISA 試劑盒說明書（江蘇晶美），對(duì)各腸段IL-1β、IL-4、TNF-α 和IFN-γ 進(jìn)行定量分析，檢測方法參照ELISA試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件中IndependentT-test 程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示，顯著性置于0.05 水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭對(duì)大鼠腸道病理學(xué)損傷

由表3 及圖1A 可知，與對(duì)照組相比，十二指腸黏膜層炎性細(xì)胞浸潤，腸絨毛出血及頂端輕度壞死脫落；空腸可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜下層血管充血擴(kuò)張，部分絨毛頂端糜爛性壞死甚至脫落，壞死脫落的柱狀細(xì)胞細(xì)胞核破碎、裂解、變形、散見少量紅細(xì)胞；回腸固有層與上皮層炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)較大面積黏膜層絨毛頂端組織結(jié)構(gòu)破壞，大量腸絨毛頂端凝固性壞死，并伴有出血；盲腸黏膜下層水腫，固有層輕度充血；結(jié)腸肌層增厚，固有層淋巴細(xì)胞增多；直腸漿膜水腫，腸腺變短，黏膜層及黏膜下層有大量淋巴細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)淋巴細(xì)胞增生，局部黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落。

同時(shí)對(duì)各腸段進(jìn)行量化評(píng)分，試驗(yàn)組各腸段組織學(xué)評(píng)分均極顯著增加（P＜0.01），其中十二指腸評(píng)分增加495.23%，空腸評(píng)分增加511.36%，回腸評(píng)分增加722.36%，盲腸評(píng)分增加366.67%，結(jié)腸評(píng)分增加436.50%，直腸評(píng)分增加976.00%（表3）。

2.2 紫莖澤蘭對(duì)大鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響

由表4 可知，與對(duì)照組相比，采食紫莖澤蘭可使大鼠十二指腸絨毛高度、隱窩深度及其比值極顯著增加（P＜0.01）；使空腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度比值極顯著增加（P＜0.01），而隱窩深度雖有增加但無顯著性差異（P＞0.05）；使回腸絨毛高度、隱窩深度及其比值極顯著增加（P＜0.01）。其中絨毛損傷以空腸最為顯著，較對(duì)照組絨毛高度降低24.72%，隱窩損傷以十二指腸損傷最為嚴(yán)重，較對(duì)照組隱窩深度增加249.27%。

2.3 IELs、LPLs 和GCs 計(jì)數(shù)結(jié)果

由圖1B 和表5 可知，與對(duì)照組相比，采食紫莖澤蘭可極顯著增加大鼠各腸段IELs、LPLs 和GCs 數(shù)量（P＜0.01）。小腸以回腸IELs、LPLs 和GCs 增加量變化最大，增加量分別達(dá)到125.64%、33.91%和48.19%；而在大腸中結(jié)腸和直腸IELs 與LPLs 增加量最為顯著，其中結(jié)腸IELs 與LPLs 增加量分別為95.65%與59.20%，直腸IELs 與LPLs 增加量分別為93.33%與74.71%，直腸GCs 增加56.73%。

2.4 紫莖澤蘭對(duì)大鼠腸道黏膜sIgA 含量的影響

由表6 可知，與對(duì)照組相比，采食紫莖澤蘭使大鼠各腸段sIgA 表達(dá)量均極顯著增加（P＜0.01）。其中十二指腸、空腸、回腸sIgA 增加量均達(dá)到了80%以上，其中空腸增加量最高，達(dá)119.11%；而盲腸、結(jié)腸、直腸增加量相對(duì)較低，以結(jié)腸sIgA 表達(dá)量增加最低，為12.83%。

2.5 腸道黏膜炎性細(xì)胞因子表達(dá)

由表7 可知，與對(duì)照組相比，各腸段促炎因子（IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ）mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量均有不同程度的增加，抑炎因子（IL-4、IL-10）mRNA 表達(dá)量和蛋白分泌量均有不同程度的減少。其中小腸以空腸和回腸炎性因子顯著增加或減少（P＜0.05），大腸以直腸炎性因子極顯著增加或減少（P＜0.01）。

3 討論

腸道是機(jī)體內(nèi)最大的內(nèi)分泌和免疫器官［14］，在維持腸道平衡穩(wěn)態(tài)中有著重要作用，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂紫莖澤蘭會(huì)導(dǎo)致小腸出現(xiàn)以絨毛出血性壞死和糜爛脫落為特征的病理損傷，大腸出現(xiàn)以漿膜水腫，上皮層充血和大量淋巴細(xì)胞浸潤為特征的病理損傷，同時(shí)對(duì)小腸進(jìn)行形態(tài)學(xué)測量，結(jié)果顯示，小腸絨毛高度極顯著降低，隱窩深度表現(xiàn)不同程度的加深，二者比值均極顯著增加，研究表明，絨毛主要發(fā)揮吸收作用，長度增加則吸收功能增強(qiáng)，反之降低，而隱窩主要發(fā)揮分泌作用，其深度可反映腸上皮細(xì)胞成熟率，變深則腸上皮細(xì)胞成熟率降低，反之則表明腸上皮細(xì)胞成熟率上升，絨毛高度與隱窩深度的比值則綜合反映了腸道的健康狀況，比值下降表明腸道受損［15］。腸道由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜，被分為小腸和大腸，其各自特殊的腸道結(jié)構(gòu)是構(gòu)成腸道物理屏障的重要組成部分［16］，從本試驗(yàn)結(jié)果來看，紫莖澤蘭可通過損傷腸道組織結(jié)構(gòu)，降低小腸的吸收功能，降低腸上皮細(xì)胞成熟率，增加腸上皮的通透性，使腸道機(jī)械屏障的完整性被破壞。

腸道免疫系統(tǒng)由多個(gè)水平共同構(gòu)成免疫屏障［17］，以抵御病原微生物的入侵，其中腸道免疫細(xì)胞及其分泌蛋白在此過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，腸道淋巴細(xì)胞的總數(shù)遠(yuǎn)超其存在于骨髓、胸腺、脾臟以及淋巴結(jié)中的數(shù)量［18］，腸道內(nèi)淋巴細(xì)胞根據(jù)其分布的不同，可分為IELs 和LPLs。IELs 是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先與外來抗原接觸的免疫細(xì)胞［19］，是一種快速有效的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物［20］，可分泌包括IL-2、IL-4、IL-10 及IFN-γ 等多種細(xì)胞因子［21?22］，能夠促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞再生、保持腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，保護(hù)黏膜免受病原菌的侵害［22］。LPLs 參與宿主防御感染、代謝穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)［23］，有助于維持上皮的完整性，并在腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)維持穩(wěn)態(tài)［24?25］。GCs 是一種典型的黏液細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)充滿黏液顆粒，黏液顆粒內(nèi)富含黏蛋白，分泌排出后與水混合可形成黏液，附著在腸黏膜表面，對(duì)組織表面起到潤滑和保護(hù)作用，PAS 反應(yīng)呈強(qiáng)陽性，因此，GCs 數(shù)量的多少反映了腸黏膜的健康狀況，是腸黏膜異常的一個(gè)敏感指標(biāo)。而sIgA 可阻止病原體在腸黏膜表面粘附，并中和腸毒素，抑制病原在腸黏膜上皮的移動(dòng)，進(jìn)而維持腸黏膜上皮的完整，因此sIgA 在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用，且腸道黏膜分布著機(jī)體約80%的sIgA 細(xì)胞［26］，高sIgA 水平通常表明機(jī)體正在發(fā)生過度免疫反應(yīng)，提示腸道黏膜免疫的激活，同時(shí)sIgA 的分泌也受到輔助性T 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子調(diào)控，如IL-2、TNF-γ、IL-4 和IL-10 等，都可促進(jìn)sIgA 的分泌［27］，多種炎性細(xì)胞因子可損害腸上皮細(xì)胞屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼喂紫莖澤蘭可通過增加各腸段IELs、LPLs 和GCs 數(shù)量，升高黏膜內(nèi)sIgA 水平，表明紫莖澤蘭通過增加免疫細(xì)胞的數(shù)量和具有免疫活性的蛋白引起腸道感染或炎癥，從而觸發(fā)過度免疫反應(yīng)表達(dá)。

有研究者［28］認(rèn)為，細(xì)胞因子可以通過不同的途徑誘導(dǎo)腸黏膜屏障損傷，且在腸道黏膜屏障發(fā)生損傷時(shí)細(xì)胞因子會(huì)顯著激活免疫反應(yīng)［29］，已證實(shí)TNF（tumor necrosis factor，TNF）會(huì)使腸道黏膜屏障破壞，且TNF 幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)導(dǎo)致屏障破壞［30?31］。此外，TNF 可通過誘導(dǎo)MLCK 通路發(fā)揮其調(diào)控屏障功能，而IFN-γ 在腸上皮細(xì)胞中也可通過誘導(dǎo)TNFR2 的表達(dá)啟動(dòng)這一調(diào)節(jié)通路［32］，表明多種因子間在調(diào)控腸道黏膜屏障中可相互影響，共同調(diào)控腸道黏膜免疫。IL-1β 和IL-2 是常見的促炎因子，IL-4 和IL-10 是常見的抑炎因子，這些細(xì)胞因子在調(diào)控腸道黏膜屏障中也有一定的作用，例如楊華等［33］用大腸桿菌刺激豬腸道上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高，而IL-10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，且在使用丁酸梭菌治療后細(xì)胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平又顯著降低；也有研究表明腸紊亂后IL-1β 表達(dá)量增加，IL-4 表達(dá)量顯著降低［34］，同時(shí)，前期研究結(jié)果顯示，紫莖澤蘭可引起動(dòng)物機(jī)體血清中IL-2 等細(xì)胞因子顯著增加，提示全身性炎性反應(yīng)［35］，因此在本試驗(yàn)中，促炎因子IL-1β，IL-2，TNF-α 和IFN-γ mRNA 水平與蛋白水平的表達(dá)量增高，抑炎因子IL-4 和IL-10 mRNA 水平與蛋白水平的表達(dá)量降低，表明紫莖澤蘭可引起大鼠腸道炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)控細(xì)胞因子的分泌，從而激活腸道黏膜免疫，這與宋曉平［36］在有毒植物狼毒（Stellera chamaejasme）中的研究結(jié)果一致，狼毒中總黃酮對(duì)胃腸道有刺激作用，可使胃腸道組織結(jié)構(gòu)破壞，腸黏膜功能異常，而紫莖澤蘭是否通過調(diào)控緊密連接或其他調(diào)節(jié)通路增加腸道黏膜通透性還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

紫莖澤蘭可使大鼠出現(xiàn)以十二指腸絨毛出血、空腸絨毛頂端糜爛性壞死、回腸絨毛頂端凝固性壞死、盲腸黏膜下層水腫、結(jié)腸淋巴細(xì)胞增多、直腸淋巴細(xì)胞增生為病理特征的腸道結(jié)構(gòu)損傷，還可不同程度的降低小腸各段絨毛高度、加深隱窩深度、增加絨毛高度/隱窩深度，進(jìn)一步破壞腸道結(jié)構(gòu)，同時(shí)紫莖澤蘭可通過增加各腸段IELs、LPLs、GCs 數(shù)量，升高黏膜內(nèi)sIgA 分泌量，增加促炎因子IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ 表達(dá)量，降低抑炎因子IL-4 和IL-10 表達(dá)量，從而激活腸道黏膜免疫，揭示紫莖澤蘭對(duì)大鼠腸道的毒性損傷作用。