孟慶輝 唐桂華

食品安全是社會大眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題，也是世界公認(rèn)的解決難度最大的公共衛(wèi)生問題。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)水平大幅度提升，人民的物質(zhì)生活和以往相比得到大幅度改善，對食品安全也提出了更高的要求，如何提升食品微生物檢測成效和質(zhì)量已成為當(dāng)前食品安全工作發(fā)展的趨勢。常見致病菌包括副溶血性孤菌和沙門氏菌等，高效檢測上述致病菌能切實(shí)保障食品安全。但做好上述工作需要成熟的檢測技術(shù)。PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）以操作便利、快速以及靈敏等優(yōu)勢在食品微生物檢測中得到廣泛應(yīng)用，該技術(shù)還可鑒定細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)，以及檢測原理明確食品微生物情況。本文基于PCR技術(shù)分析其微生物檢測具體應(yīng)用，望給予食品檢測人員以及相關(guān)研究者提供參考。

一、PCR概述

（一）基本原理

PCR是一種具有選擇特性的且在體外對DNA或RNA片段擴(kuò)增方式，其反應(yīng)原理基本類似于細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制。然而PCR反應(yīng)體系相較于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制更為簡單，主要涵蓋四種dNTP、緩沖液體系、耐熱DNA聚合酶、DNA靶序列及其DNA靶序列單鏈3末端行互補(bǔ)的合成引物。PCR由低溫退火、高溫變性、適溫延伸三個反復(fù)熱循環(huán)步驟組成。其中低溫退火即模板DAN會通過變性分解至兩條單鏈，該單鏈經(jīng)引物退火、降低溫度以及與互補(bǔ)DNA模板相結(jié)合后形成局部雙鏈，由此形成DNA復(fù)制起點(diǎn)。高溫變性即在95℃的高溫環(huán)境中，雙鏈DNA模板造成氫鏈斷裂，進(jìn)而分離雙鏈后形成單鏈DNA，也稱之為變性。經(jīng)變性的單鏈可在此結(jié)合且能同時恢復(fù)性質(zhì)。適溫延伸即當(dāng)模板與引物相結(jié)合后受DNA多聚酶作用影響，從引物5端延伸至3端，與模板互補(bǔ)的DNA鏈由此合成，DNA含量經(jīng)上述循環(huán)后增加1倍。

（二）基本成分

PCR反應(yīng)的主要成分有以下組成：核苷酸引物（一對）、模板DNA、三磷酸脫氧核苷酸（四種）、耐熱DNA聚合酶、緩沖液、部分離子。其中模板即需擴(kuò)增序列的核苷酸，PCR反應(yīng)模板可由所有形式的RNA與DNA組成。引物即將靶DNA3端與5端異性相結(jié)合的核苷酸片段，PCR特異性由上述片段決定。緩沖液即維持PCR反應(yīng)pH，廣泛應(yīng)用的Tris-HCl在10-50mol/L范圍內(nèi)，pH變化在PCR反應(yīng)中的6.8-7.8。耐熱DNA聚合酶即保證PCR自動化實(shí)現(xiàn)，該物質(zhì)可承受95℃以上高溫且不會喪失原有活性。三磷酸脫氧核苷酸，即PCR反應(yīng)原料為dGTP、dTTP、dATP、dCTP三磷酸脫氧核苷酸。除dNTP溶液pH為7.0外，其他dNTP濃度均在2.5mmol/L間，通常使用濃度控制在20-200umo/L，為降低錯配發(fā)生率，需保證各個dNTP分子濃度相等。

（三）反應(yīng)系統(tǒng)組成

PCR反應(yīng)系統(tǒng)由TaqDNA聚合酶的量、PCR緩沖液、石蠟油、模板以及四種脫氧三磷核苷酸組成。

（四）優(yōu)勢

1.操作便捷簡單

以往在檢測食品微生物時多以自動化檢測技術(shù)為主，經(jīng)長期實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)檢測技術(shù)檢測時間長，整體檢測準(zhǔn)確性與檢測效率偏低，工作人員任務(wù)繁重。PCR檢測技術(shù)是科學(xué)技術(shù)發(fā)展中延伸而出的高自動化檢測技術(shù)，運(yùn)用PCR技術(shù)和相應(yīng)的檢測程序即可檢測食品多種微生物，一人可獨(dú)立完成檢測工作，操作簡單且系統(tǒng)自動化程度高，最重要的是檢測時效性佳、效率高，為食品衛(wèi)生安全提供基本技術(shù)支持的同時，推動了食品微生物檢測工作的迅速發(fā)展。

2.檢測效率高

以往食品微生物檢測花費(fèi)的檢測周期為2-4d，若檢測種類較多則需7d完成。再加上大部分食品為保質(zhì)期較短的即食性食物，部分商家未等到食品微生物檢測結(jié)果就直接銷售，造成食品微生物檢測滯后現(xiàn)象嚴(yán)重。若發(fā)現(xiàn)食品衛(wèi)生安全問題則會召回已銷售食品，在此過程中極有可能發(fā)生食品安全事故，造成不可預(yù)估的經(jīng)濟(jì)和品牌口碑損失。PCR檢測效率高，通常只需數(shù)小時就可完成對食品微生物的檢測，結(jié)果出示時間為1d左右。

3.檢測準(zhǔn)確率高

由于分離培養(yǎng)、生化鑒定等傳統(tǒng)檢測方式在檢測食品微生物時面臨的困難較多，進(jìn)而降低檢測準(zhǔn)確率，不利于對食品微生物種類及其產(chǎn)生的危害性進(jìn)行準(zhǔn)確辨別。PCR技術(shù)在現(xiàn)代食品微生物檢測中發(fā)揮著不可小覷的作用，該技術(shù)可同時對多種食品微生物進(jìn)行檢測，且能運(yùn)用先進(jìn)的PCR技術(shù)準(zhǔn)確辨別微生物種類及其危害性，保證食品衛(wèi)生安全的同時，使食品微生物檢測準(zhǔn)確率得到大幅度提升。

（五）影響因素

影響PCR的因素共有以下幾個方面：①引物設(shè)計(jì)。通常需運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算引物長度，要求引物組成與CG%含量比例平均，盡可能防止引物內(nèi)部形成顯著次級結(jié)構(gòu)。②溫度循環(huán)參數(shù)。參數(shù)由循環(huán)次數(shù)、引物退火溫度、引物延伸溫度以及模板變性溫度等組成。③擴(kuò)增平坡。當(dāng)擴(kuò)增歷經(jīng)相應(yīng)的循環(huán)周期后，需擴(kuò)增片段則進(jìn)入平坡循環(huán)次數(shù)，并非根據(jù)不斷增多的隨指數(shù)進(jìn)入平坡，上述現(xiàn)象與已有的模板拷貝數(shù)與合成DNA總量有關(guān)。所謂平坡即PCR循環(huán)后期，當(dāng)合成產(chǎn)物達(dá)至0.3-1pmol時，原有基于指數(shù)增加的速率會因堆積的產(chǎn)物變成平坦。導(dǎo)致PCR進(jìn)入平坡因素多以已消耗完畢的引物與dNTP及Taq酶失去活性等有關(guān)。④PCR特異性。緩沖液濃度改變、酶與引物濃度降低、簡短退火與退火溫度時間及避免模板已有的次級結(jié)構(gòu)等。⑤DNA聚合酶選用。第二段耐熱DNA聚合酶Stoffel片段、RTth逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶等。

二、PCR技術(shù)在具體應(yīng)用中的測定方式

PCR技術(shù)因自身表現(xiàn)優(yōu)異，進(jìn)而廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品檢測工作。例如，食品檢測中常見的大腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌均能經(jīng)PCR技術(shù)檢測。例如，金黃色葡萄球菌會迅速在蔬菜和水果中繁殖，若長期存放蔬菜水果則會導(dǎo)致大量繁殖的金黃色葡萄球菌出現(xiàn)在果蔬表面。金黃色葡萄球菌的代謝產(chǎn)物腸毒素會嚴(yán)重?fù)p傷人體，若情況嚴(yán)重則會導(dǎo)致食用者中毒，故而在檢查食品時需科學(xué)檢查類似菌，消除細(xì)菌對人體造成的危害。PCR技術(shù)可檢測食物樣品微量元素與相關(guān)物質(zhì)且具有較高的檢測精度。食品生產(chǎn)企業(yè)在食品出廠前運(yùn)用PCR技術(shù)檢驗(yàn)可有效避免市場流入非合格食品。在檢測過程中通過標(biāo)記特定蛋白以及檢測蛋白，獲取檢測微生物含量。當(dāng)前在食品微生物檢測中廣泛應(yīng)用PCR技術(shù)，可有效檢測不同的被檢測菌，大幅度提升檢測準(zhǔn)確率。

（一）常規(guī)PCR檢測法

食品微生物的常用檢測方式即常規(guī)PCR檢測法，即將測定目標(biāo)物質(zhì)中的DNA模板和及其反應(yīng)產(chǎn)生的引物相混合。在檢測中將一定量的聚合酶加入混合后的混合物中，就可制作基本檢測樣本。在后續(xù)檢測中還需在特定反應(yīng)條件與溫度下開展培養(yǎng)反應(yīng)活動。添加聚合酶的混合物在適合溫度環(huán)境下受聚合酶作用影響，引領(lǐng)目標(biāo)物質(zhì)行電腦模板序列下擴(kuò)增，模板DNA片段經(jīng)多個周期后會持續(xù)進(jìn)行復(fù)制與擴(kuò)增。與此同時，在檢測中，測定目標(biāo)物上所具有的DNA能直接反映被檢測食品在相應(yīng)時間中形成的微生物數(shù)量與種類。以往檢測方式即通過DNA復(fù)制與擴(kuò)增能力將少量且潛在微生物群轉(zhuǎn)至可觀性較強(qiáng)的微生物群，達(dá)到檢測食品微生物的目的。

（二）多重PCR檢測法

多重PCR檢測法是對常規(guī)PCR檢測法的調(diào)整與創(chuàng)新。如果說常規(guī)PCR技術(shù)在檢測中運(yùn)用單引物，那么多重PCR檢測技術(shù)則運(yùn)用多個DNA引物檢測。例如，將兩個或兩個以上反應(yīng)引物添加至同一PCR反應(yīng)體系，上述引物需在聚合酶作用下持續(xù)復(fù)制與擴(kuò)增。由于在反應(yīng)前添加多個DNA引物，經(jīng)聚合酶反應(yīng)后可獲取多個不同的DNA反應(yīng)片段，故而多重PCR檢測方式可測定分析微生物的多個致病菌，使檢測效率與準(zhǔn)確率得到大幅度提升。多重PCR檢測技術(shù)與傳統(tǒng)PCR檢測法相比可分析出更多的致病因子，防止在檢測中發(fā)生遺漏被檢測菌現(xiàn)象，使檢測更為嚴(yán)謹(jǐn)。對此，在食品微生物檢測中，除檢測特殊致病菌外，運(yùn)用多重PCR檢測法可檢測食品微生物，避免發(fā)生遺漏檢測內(nèi)容，縮短檢測時間，減少工作人員負(fù)擔(dān)，切實(shí)提升食品微生物的檢測準(zhǔn)確率。此外，多重PCR檢測法投入的樣本相對較少，經(jīng)濟(jì)效益高，可檢測多個基因。

（三） PR-PCR檢測法

PR-PCR檢測是常規(guī)PCR檢測法的變形形式，雖不同于常規(guī)檢測法，然而該檢測技術(shù)在檢測食品微生物中有顯著優(yōu)勢。該檢測技術(shù)原理，即提取細(xì)胞或組織中的總RNA并以mRNA作為模板，運(yùn)用隨機(jī)引物或01igo和逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。同時，基于cDNA模板行PCR擴(kuò)增，由此獲取檢測基因或目的基因表達(dá)。與常規(guī)PCR檢測方式相比，PR-PCR檢測對檢測目標(biāo)物中的一條RNA行逆轉(zhuǎn)錄，之后就會產(chǎn)生互補(bǔ)DNA并基于此行復(fù)制與擴(kuò)增。應(yīng)用該檢測技術(shù)需明確的是，逆轉(zhuǎn)錄DNA模板處于完整狀態(tài)且不含任何蛋白質(zhì)或雜質(zhì)，保證基因鏈完整。在檢測食品微生物時可應(yīng)用于微生物檢測定量分析，如將數(shù)字技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合的PCR檢測，通過定量分析測定目標(biāo)中的微生物后再行檢測，可有效保證檢測中高靈敏性，更能獲得準(zhǔn)確檢測結(jié)果。所以，運(yùn)用PR-PCR檢測法檢測食品微生物可針對性地對微生物進(jìn)行檢測，保證高精準(zhǔn)度的檢測結(jié)果。

三、PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

（一）應(yīng)用PCR技術(shù)檢測海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌

海產(chǎn)品中常見的細(xì)菌種類即副溶血性弧菌，人類一旦食用含有副溶血性弧菌的海產(chǎn)品則會引發(fā)急性腸胃炎，所以副溶血性弧菌是最為重要的食源性疾病病原菌類型。相關(guān)研究指出，副溶血性弧菌在沿海國家與地區(qū)的海產(chǎn)品中具有相對嚴(yán)重的污染率，其中軟體類、甲殼類、貝類、魚類等海產(chǎn)品有著較高的檢出率，受污染程度與海域環(huán)境條件、海產(chǎn)品類別等有著緊密聯(lián)系。綜觀近年來的檢測結(jié)果得知，淡水產(chǎn)品發(fā)生副溶血性弧菌的概率呈顯著上升趨勢，且具有季節(jié)性、多環(huán)節(jié)與多物種等高污染特征。當(dāng)前檢測食品中副溶血性弧菌多采取快速檢測法與傳統(tǒng)檢測法，使用率最高的則為傳統(tǒng)副溶血性弧菌檢測法，因檢測便利且價(jià)格低廉受到歡迎，然而該檢測方式靈敏度低且耗費(fèi)大量時間。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，針對食品中的副溶血性弧菌檢測也有所創(chuàng)新，很多科技企業(yè)相繼推出如PCR-探針法（副溶血性弧菌核酸檢測試劑盒）等特異性強(qiáng)、便利且迅速的檢測方式，對提升檢測效率和質(zhì)量方面有著重要現(xiàn)實(shí)意義。相關(guān)研究文獻(xiàn)指出，目前有22種快速檢測食品中的副溶血性弧菌方式，如基于分子生物學(xué)的PCR-變性高效液相色譜法、基于細(xì)菌培養(yǎng)與生化鑒定的顯色培養(yǎng)激法、基于噬菌體特異性的噬菌體鑒定技術(shù)、基于免疫學(xué)為基礎(chǔ)的免疫膠體金技術(shù)法、基于信號轉(zhuǎn)換與生物識別的生物傳感器技術(shù)、基于單克隆抗體與細(xì)胞分子水平的流式細(xì)胞術(shù)。

（二）應(yīng)用PCR技術(shù)檢測生鮮食品食源性病原微生物

所謂生鮮食品即尚未對食物進(jìn)行加工或初步簡單加工即可食用的食品，如果蔬、肉制品、水產(chǎn)品等。運(yùn)用多重PCR技術(shù)檢測生鮮食品可有效改變傳統(tǒng)檢測技術(shù)存在的不足。一般多重PCR技術(shù)針對不同類型病原微生物的特異性與明暗性較高，且在檢驗(yàn)非活菌時展現(xiàn)的檢測效果更為顯著，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。相關(guān)研究者運(yùn)用多重PCR技術(shù)可在4h內(nèi)檢測近6種食源性病原微生物。相關(guān)研究者所研究的巢式PCR檢測引物靈敏度高出常規(guī)PCR檢測靈敏度近1萬倍，提示在檢測生鮮食品食源性病原微生物中應(yīng)用多重PCR技術(shù)效果顯著。

（三）應(yīng)用PCR技術(shù)檢測大腸桿菌

大腸桿菌也稱為大腸埃希氏菌，該病菌在一定條件下可引起多種動物與人發(fā)生尿道、胃腸道等多種局部組織器官感染。大腸桿菌屬于寄居在動物腸道中的病菌，有一小部分受相應(yīng)條件影響而引發(fā)疾病。與此同時，大腸桿菌的血清型會引發(fā)動物或人體腸道感染，多由特定的致病性毒素與菌毛抗原等感染引發(fā)。除典型的腸道感染，還會引發(fā)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、尿道感染以及敗血型感染等疾病。當(dāng)前人類廣泛關(guān)注對食品中的大腸桿菌的快速準(zhǔn)確檢測，常用濾膜法、發(fā)酵法、平板計(jì)數(shù)法、ATP生物發(fā)光法、自動化儀器檢測法等，由于大腸桿菌具有毒性且具有一致性，部分檢測方式在準(zhǔn)確率方面存在不足。在微生物檢測中應(yīng)用PCR技術(shù)則為檢測大腸桿菌中的DNA雙鏈，經(jīng)PCR技術(shù)于免疫磁分離技術(shù)相結(jié)合使大腸桿菌的檢測準(zhǔn)確率得到大幅度提升，對保障食品安全有著重要現(xiàn)實(shí)意義。

（四）應(yīng)用PCR技術(shù)檢測乳制品沙門氏菌

乳制品質(zhì)量把控是食品安全管理的重要組成部分，若在生產(chǎn)乳制品中未合理應(yīng)用生產(chǎn)環(huán)境控制技術(shù)，則會導(dǎo)致乳制品中寄存具有感染性質(zhì)的病原微生物。常規(guī)乳制品檢測方式為培養(yǎng)微生物后運(yùn)用生化反應(yīng)檢測，但整體檢測速度慢且準(zhǔn)確率偏低。運(yùn)用PCR技術(shù)檢測乳制品中的沙門氏菌可使特定目標(biāo)物片段得到擴(kuò)增，再經(jīng)Mg2+催化TaqDNA聚合酶，提升其活化性能，達(dá)到片段擴(kuò)增目的。相關(guān)研究者指出，運(yùn)用基于免疫磁珠技術(shù)于PCR檢測技術(shù)的PCR檢測+磁珠富集檢測乳制品沙門氏菌準(zhǔn)確率高，操作便利，更為解決食品檢測前的時間縮短問題提供了解決路徑。相關(guān)學(xué)者在監(jiān)測復(fù)合調(diào)味料沙門氏菌中根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)檢測法增加細(xì)菌再行涂布XLD與BS平板，基于沙門氏菌特定序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物，篩選出疑似菌落后測試菌液PCR反應(yīng)，不僅縮短了檢測沙門菌的時間，更大幅度提升了檢測準(zhǔn)確率和效率。

結(jié)語

總之，食品安全是重要的民生問題，雖然相關(guān)部門加大了對食品安全管理的力度，然而，群體性食品安全事件仍時有發(fā)生。借助現(xiàn)代技術(shù)可使食品微生物檢測效率與準(zhǔn)確率得到大幅度提升，迅速判斷食品問題原因，為高效解決食品安全事件奠定基礎(chǔ)。本文研究分析的PCR技術(shù)在食品微生物檢測中以便利、高效等優(yōu)勢得到青睞。在未來發(fā)展中，PCR技術(shù)會逐漸普及并廣泛應(yīng)用于食品微生物檢測，并與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)熱點(diǎn)之一的數(shù)學(xué)技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)一步提升食品檢測質(zhì)量，保障食品安全，推動食品檢測的高效有序發(fā)展。