易芳 來鵬程 鄭希鰲 胡帥 高燕麗

（浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 311300）

在原核細胞和真核細胞DNA復(fù)制過程中，每聚合108-1010個核苷酸就會摻入一個錯誤配對的核苷酸，為保證DNA復(fù)制的準確性，細胞內(nèi)復(fù)制型DNA聚合酶通過發(fā)揮校正錯誤配對核苷酸的能力而保證遺傳信息的準確性［1］。自20世紀80年代，Mullis等［2］發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)從而實現(xiàn)了DNA體外快速擴增，該技術(shù)的問世和發(fā)展對分子生物學(xué)研究領(lǐng)域具有劃時代的意義。聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）可看作是生物體外一種特殊的DNA復(fù)制方式，利用DNA聚合酶耐高溫和核苷酸校準的特性，能將微量DNA以幾何倍數(shù)的增加方式而達到百萬倍擴增。因此在PCR技術(shù)應(yīng)用過程中，DNA聚合酶發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1］。

最早應(yīng)用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是由Escherichia coli（E. coli）DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端具有605個氨基酸殘基片段的Klenow酶，該酶具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，但不具有5'-3'外切酶活性［1，3-4］。由于Klenow酶在使用過程中存在不耐高溫等缺陷，因此尋找具有優(yōu)良特性的DNA聚合酶取代Klenow酶成為最適用PCR反應(yīng)用酶的問題亟待解決。20世紀70年代，Chien等［5］從黃石國家公園溫泉中的水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中成功分離出能在80℃穩(wěn)定存在的DNA聚合酶-Taq酶。它具有能以單鏈DNA為模板合成互補DNA鏈，即使在97.5℃下仍能發(fā)揮最佳效果，且在72℃條件下，10 s內(nèi)復(fù)制1 kb的DNA鏈等特性，這些優(yōu)良特征使得DNA體外擴增成為了可能［6］。隨后，以Taq DNA聚合酶活性為基礎(chǔ)而發(fā)明的PCR和分子克隆技術(shù)逐漸成為擴增基因序列最重要的手段，并被廣泛應(yīng)用于基因工程、疾病診斷、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域［2，7-9］。 即便如此，其在實際應(yīng)用過程中仍受到一定限制，主要表現(xiàn)在其缺乏3'-5'外切核酸酶校正活性，致使其在擴增長片段DNA時容易摻入過多錯誤堿基致使PCR反應(yīng)提前終止，導(dǎo)致常規(guī)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的長度受限于3 kb以下［4，10-11］。除Taq酶之外，與大腸桿菌DNA聚合酶Ⅱ同源的DNA聚合酶（B型DNA聚合酶），因其具有3'-5'外切核酸酶校正活性和高保真性［12］，也廣泛應(yīng)用于PCR，例如從嗜熱古細菌（Pyrococcus Kodakaraensis）中分離純化得到的Kod高保真酶就屬于這類具有強校準功能并且耐熱性良好的DNA聚合酶［13］。與Taq DNA聚合酶相比，Kod聚合酶可更快更準確的達到PCR擴增效果，其擴增速度至少是Taq DNA聚合酶的2倍；同時由于其具有的3'-5'核酸外切酶活性（校正活性），可準確地對目的片段進行擴增，從而降低了PCR擴增過程中錯誤摻入核苷酸的機會［14］。

本研究通過對Kod DNA聚合酶表達和純化的條件進行優(yōu)化，來獲得具有高效擴增能力的Kod DNA聚合酶，旨為探究分離純化Kod DNA聚合酶提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用蛋白原核表達菌種Rosetta（DE3）以及原核表達載體pET-30a-Kod均由浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院智能實驗樓N405實驗室保存，市售商品化高保真酶Promega GoTaq?DNA Polymerase試劑盒（M7808）購于Promega公司。

PCR試驗所用模板DNA提取于野生型擬南芥幼苗，試驗需要擴增的基因為擬南芥液泡分選受體AtVSR6基因組DNA（AT1G30900），片段長度為3 194 bp，該基因引物由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 Kod DNA聚合酶的誘導(dǎo)表達 將pET-30a-Kod質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至蛋白原核表達菌株Rosetta（DE3）中，37℃復(fù)性1 h后涂布于含氨芐霉素（100 mg/mL）的固體LB平板上37℃過夜生成菌落，利用菌落PCR挑選出陽性單克隆并接種于含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃，250 r/min培養(yǎng)至OD600介于0.6-0.8之間，加入不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG（0.1 mmol/L、0.2 mmol/L），置于28℃恒溫搖床，250 r/min培養(yǎng)16-18 h后，取出100 μL菌液加入5×SDS上樣緩沖液，100℃加熱10 min使菌株破碎變性，12 000 r/min離心1 min，取20 μL上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和考馬斯亮藍染色分析。

1.2.2 Kod DNA聚合酶的提取 將50 mL培養(yǎng)16-18 h的pET-30a-Kod菌 液4℃ 6 000 r/min離 心15 min，去上清收集菌體；加入提前預(yù)冷的10 mL裂解液（4 mg/mL Lysozyme，0.01 mol/L PBS，pH 7.4）重懸菌體；在冰浴條件下使用超聲破碎儀破碎菌液直至菌液清澈（超聲27 s，間隙3 s，輸出功率15%），將清澈菌液4℃ 10 000 r/min離心30 min并收集上清，即為Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），將Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）置于75℃烘箱1 h，去除不耐熱的雜蛋白，4℃ 12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的15 mL離心管中，并將其置于冰上，用等體積1×PBS重懸浮沉淀，即殘渣重懸液（CMKod）。

1.2.3 Kod DNA聚合酶的純化及優(yōu)化 預(yù)先用1×PBS洗滌Ni-NTA柱，750 r/min離心30 s，再將Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）加入Ni-NTA柱，每次600 μL，750 r/min離心30 s，收集洗脫液上清；再次使用1 × PBS洗滌Ni-NTA柱5次，最后在Ni-NTA柱中加入含有不同濃度咪唑（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L）的洗脫緩沖液（50 mmol/L KCl，50 mmol/L Tris-HCl，pH=8.0），靜置30 s，4℃ 750 r/min離心30 s并收集洗脫液，即為純化后的Kod DNA聚合酶。

剪取10 cm透析膜袋，用ddH2O浸潤，并用夾子對透析膜一端進行封口；將包含Kod DNA聚合酶的洗脫緩沖液加入透析膜袋中，并將其置于裝有儲藏緩沖液（0.1 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，50% Glycerol，50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）的燒杯中，置于4℃并利用磁力攪拌器緩慢攪拌，4 h后置換儲藏緩沖液，過夜透析12 h后，將透析膜中的溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入5 μL MgCl2（1 mol/L）和10 μL DNase I（10 U/μL），置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min；70℃加熱10 min，使DNase I失去活性，14 000 r/min離心5 min；取上清液至新的1.5 mL離心管，并用儲藏緩沖液1∶1稀釋，即Kod DNA聚合酶原液，-80℃保存。

取20 μL Kod DNA聚合酶原液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并用考馬斯亮藍染色分析Kod DNA聚合酶的濃度。

1.2.4 Kod DNA聚合酶的活性檢測 利用PCR分析自提純化的Kod DNA聚合酶的活性。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL，反應(yīng)組成為：2.5 μL野生型擬南芥基 因 組DNA，12.5 μL 2 × PCR buffer，2.5 μL BSA（1 mg/mL），1 μL上 下游 引 物（10 μmol/L，表1），0.5 μL dNTP（10 mmol/L），1 μL不同濃度自提純化的Kod DNA聚合酶，同時以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作為對照，最后ddH2O補足25 μL。

表1 PCR擴增引物信息Table 1 Information of the primers used for PCR

PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s；58℃退火15 s；72℃延伸時間根據(jù)模板長度而定（≤1 kb設(shè)置為1 min，≤2 kb設(shè)置為2 min）；30次循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR結(jié)束以后使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析不同濃度Kod DNA聚合酶的擴增效果。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度誘導(dǎo)劑IPTG對Kod DNA聚合酶表達的影響

利用不同濃度IPTG（0.1 mmol/L和0.2 mmol/L）對Kod DNA聚合酶誘導(dǎo)表達，通過酶溶法和超聲波破碎法從重組大腸桿菌中收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）。經(jīng)SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，所得蛋白質(zhì)分子大小為90 kD，與前人所研究的酶蛋白大小一致，表明成功誘導(dǎo)Kod DNA聚合酶表達［13］。透析后所得Kod DNA聚合酶酶原液經(jīng)儲藏緩沖液1∶1稀釋后的結(jié)果顯示，0.1 mmol/L和0.2 mmol/L IPTG均可誘導(dǎo)Kod DNA聚合酶表達（圖1）。由于IPTG對菌體有一定的毒性，因此在后續(xù)的實驗中選用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG對Kod DNA聚合酶進行誘導(dǎo)表達。

圖1 不同濃度誘導(dǎo)劑IPTG對Kod DNA聚合酶表達的 影響Fig.1 Effects of different concentrations of IPTG on the expressions of Kod DNA polymerases

2.2 不同濃度咪唑?qū)od DNA聚合酶純化的影響

經(jīng)酶溶法和超聲波破碎后的Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod）通過Ni-NTA純化時，設(shè)置含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液（500 mmol/L、200 mmol/L和100 mmol/L），以探究洗脫液中咪唑的最佳濃度。SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，當同等體積洗脫液過柱洗脫時，含有200 mmol/L和500 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫所得Kod DNA聚合酶產(chǎn)量較高（圖2）。因此，含有200 mmol/L咪唑的洗脫液可應(yīng)用于純化Kod DNA聚合酶。

圖2 不同濃度咪唑?qū)od DNA聚合酶純化的影響Fig.2 Effects of different concentrations of imidazole on the purifications of Kod DNA polymerases

2.3 條件優(yōu)化后Kod DNA聚合酶的制備效果

根據(jù)上述試驗結(jié)果顯示，確定Kod DNA聚合酶提取純化的最佳條件為：使用終濃度為0.1 mmol/L IPTG在28℃條件下誘導(dǎo)菌體16-18 h，4℃條件下離心并收集菌體；加入裂解液重懸菌體；并使用超聲波破碎儀破碎，收集Kod DNA聚合酶粗提液（CSKod），利用Ni-NTA吸附Kod DNA聚合酶，最后使用含有200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫收集純化后的Kod DNA聚合酶。按照此優(yōu)化步驟，增大誘導(dǎo)菌量對Kod DNA聚合酶進行提取純化，SDS-PAGE結(jié)果顯示，使用上述優(yōu)化條件可制備高純度且高產(chǎn)量的Kod DNA聚合酶（圖3）。最后采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為標準對照，即50 mL重組大腸桿菌中，可提取約2.5 mg Kod DNA聚合酶蛋白。

圖3 優(yōu)化條件后Kod DNA聚合酶的制備效果Fig.3 Preparation effect of Kod DNA polymerase after comprehensive optimization conditions

2.4 Kod DNA聚合酶活性檢測

2.4.1 Kod DNA聚合酶反應(yīng)體系中酶的濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響 判斷DNA聚合酶制備成功與否主要在于驗證其是否具有聚合酶的活性，因此本研究通過PCR反應(yīng)來檢測自提純化的Kod DNA聚合酶活性，并以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶作為對照。為進一步優(yōu)化Kod DNA聚合酶的擴增效率，探究了PCR反應(yīng)體系中Kod DNA聚合酶濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響。根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，自提純化的Kod DNA聚合酶濃度介于0.061 25-0.5 μg/μL均可有效擴增出AtVSR6基因（3 194 bp），而PCR反應(yīng)體系中不同Mg2+濃度（1.5 mmol/L、1.75 mmol/L、2.0 mmol/L、2.25 mmol/L）對整個PCR擴增效率無顯著影響（圖4）。

圖4 Kod DNA聚合酶PCR反應(yīng)體系中酶濃度及Mg2+濃度對目的基因擴增的影響Fig. 4 Effects of enzyme content and Mg2+ concentration on target gene amplification in Kod DNA polymerase reaction system

2.4.2 Kod DNA聚合酶的保真性 Kod DNA聚合酶作為高保真酶，對于長片段的有效擴增及堿基的低錯配率（高保真酶的保真性）是衡量其是否成功制備的重要依據(jù)。PCR反應(yīng)體系中酶含量為0.061 25 μg/μL，Mg2+濃度為1.5 mmol/L，以商品化GO Tag高保真DNA聚合酶為對照。

根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，Kod DNA聚合酶能有效地擴增出長度為3 194 bp大小的AtVSR6的目的條帶（圖5-A）。Sanger測序結(jié)果顯示，擴增片段與GenBank數(shù)據(jù)庫中AtVSR6基因序列完全匹配（圖5-B和C）。因此，自提純化的Kod DNA聚合酶擴增效率和保真性與所選商用酶相當。

圖5 Kod DNA聚合酶的保真性驗證Fig.5 High-fidelity verification of Kod DNA polymerases

3 討論

DNA聚合酶是負責(zé)生物體內(nèi)DNA復(fù)制和DNA損傷修復(fù)所必需的酶，在遺傳信息傳遞過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。隨著對DNA聚合酶的研究越來越多，其相關(guān)的制備條件也在不斷優(yōu)化發(fā)展，其中DNA聚合酶分離純化的方法主要有硫酸銨沉淀 法［15-17］、Ni柱親和色譜法［18］、AKTA蛋白純化系 統(tǒng)［19］及凍溶法［17］等，這些方法均旨在提高酶的表達量、特異性以及酶活力等［19］。

蛋白質(zhì)的表達可分為原核表達和真核表達，與真核表達相比，原核表達系統(tǒng)以能在短時間內(nèi)獲得大量基因表達產(chǎn)物，方法簡單且所需的成本低廉等優(yōu)點而被廣泛使用［20-21］。在原核蛋白表達過程中，通常在目的蛋白的N端或C端連接標簽蛋白，這使得后期蛋白純化變得更加便利，其中His標簽蛋白是一種較為廣泛使用的重組蛋白標簽，其特性是分子質(zhì)量小，對表達的重組蛋白可通過金屬離子親和層析進行純化［22-24］。本研究中Kod DNA聚合酶所使用的表達載體pET-30a帶有His標簽，由于其分子量小的特點，對于后期蛋白活性沒有顯著影響，并且在誘導(dǎo)物IPTG存在時可誘導(dǎo)Kod DNA聚合酶蛋白大量表達［25］。不同重組蛋白在進行蛋白誘導(dǎo)表達時所需的IPTG濃度各有差異［26］。本研究探究了不同IPTG濃度對Kod DNA聚合酶誘導(dǎo)表達的影響。由于高濃度的IPTG對菌體具有一定毒性，誘導(dǎo)表達時會導(dǎo)致菌體中形成大量包涵體，而以包涵體形式存在的蛋白分子不具有正確的生理結(jié)構(gòu)及生物活性，最終導(dǎo)致可溶性蛋白表達量減少［27-29］。本實驗中使用兩種濃度IPTG誘導(dǎo)表達Kod DNA聚合酶，發(fā)現(xiàn)使用0.1mmol/L IPTG即可誘導(dǎo)Kod DNA聚合酶高效表達，故選擇IPTG終濃度為0.1 mmol/L作為最優(yōu)的表達條件。

His標簽是由6個組氨酸殘基構(gòu)成，組氨酸側(cè)鏈的咪唑基能與固定化的鎳、鐵、銅等金屬離子以配位鍵形式結(jié)合，而高濃度的咪唑能通過競爭性結(jié)合使蛋白從Ni柱解離，這種特性促使His標簽廣泛應(yīng)用于蛋白分離純化［30-31］。本研究中利用不同濃度咪唑與帶His融合蛋白標簽的高保真DNA聚合酶競爭性結(jié)合Ni2＋，從而洗脫結(jié)合到Ni-NTA柱上的Kod DNA聚合酶，發(fā)現(xiàn)高濃度咪唑會洗脫大量非特異性蛋白，低濃度咪唑則會降低洗脫蛋白產(chǎn)量。因此本研究探究了不同濃度咪唑?qū)ο疵撔实挠绊?，發(fā)現(xiàn)洗脫液中咪唑濃度為200 mmol/L時，洗脫得到的Kod DNA聚合酶較多，同時雜質(zhì)蛋白較少，洗脫效果最好。由于在純化DNA高保真聚合酶過程中，會引入一定量的菌體DNA，因此在進行PCR試驗時這些菌體自帶DNA可能會污染PCR結(jié)果，從而干擾試驗［32］。因而在Kod DNA聚合酶純化過程中，如何去除菌體自帶DNA的方法也具有重要的探究價值。

自提純化的Kod DNA聚合酶能有效擴出增長達3 194 bp清晰的目的片段，這可能與其具有3'-5'外切酶校正活性有關(guān)，且經(jīng)Sanger測序及序列比對證實自提純化的Kod DNA聚合酶具有優(yōu)良的擴增能力和保真性。由此可見，本研究所提取純化的Kod DNA聚合酶的作用效果與商業(yè)化高保真DNA聚合酶效果相當，對今后實驗室自主制備DNA聚合酶提供一定的借鑒思路。

4 結(jié)論

本研究利用酶溶法和超聲波破碎法對0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達的Kod DNA聚合酶菌株破碎，利用含咪唑濃度為200 mmol/L洗脫液經(jīng)Ni-NTA柱分離純化后，成功透析制備出Kod DNA聚合酶原液，最終50 mL pET-30a-Kod菌液獲得約2.5 mg蛋白，即每毫升菌液可獲得約0.05 mg Kod DNA聚合酶。當PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度為1.5 mmol/L，Kod DNA聚合酶濃度為0.061 25 μg/μL時，能有效地擴增出目的條帶，且Kod DNA聚合酶的酶活性和擴增準確性均能達到商用高保真DNA聚合酶水平。本研究為節(jié)省實驗室PCR成本，進一步開發(fā)和利用Kod DNA聚合酶奠定了一定的基礎(chǔ)。