李宇航 王興平 楊箭 羅仍卓么 任倩倩 魏大為 馬云

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

奶牛乳腺炎發(fā)病率很高，是奶牛最常見的疾病之一，難以根除，對牧場的經(jīng)濟(jì)效益造成了巨大影響［1］。引起乳腺炎的原因復(fù)雜，主要與遺傳、病原微生物感染和飼養(yǎng)管理等多個因素有關(guān)［2］，其中遺傳因素與乳腺炎的易感性和抗病性密切相關(guān)。研究表明，奶牛乳腺炎的發(fā)生和發(fā)展過程受多個基因調(diào)節(jié)［3-4］，其分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。

microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的內(nèi)源性非編碼小RNA，長度約20-25個核苷酸，可通過靶向mRNA的3'UTR來調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而參與調(diào)節(jié)多種生理及病理過程的發(fā)生和發(fā)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是涉及炎癥、癌癥等多種疾病的重要調(diào)控因子［6-7］。就奶牛乳腺炎而言，學(xué)者們篩選了大量的乳腺炎差異表達(dá)miRNA［8-11］，但是僅有少數(shù)的miRNA進(jìn)行了功能研究。如miR-146a可通過下調(diào)Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor related factor 6，TRAF6）/核轉(zhuǎn)位因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路減輕奶牛乳腺炎癥［12］，miR-23a通過靶向磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3 kinases，PI3K）抑制乳腺炎癥反應(yīng)［13］，仍有大量的差異表達(dá)miRNA有待于進(jìn)一步探索。

MiR-665是miRNA家族成員之一。在人類的炎癥性疾病中，miR-665在結(jié)腸炎中顯著上調(diào)，通過抑制X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）和血清類黏蛋白1樣蛋白質(zhì)3（Orosomucoid 1-like 3，ORMDL3）而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和結(jié)腸炎［14］。miR-665通過靶向髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）基因抑制人脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)［15］。在小鼠中，miR-665在真菌引起的角膜炎中表達(dá)上調(diào)，通過靶向自噬相關(guān)基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）加重角膜炎癥［16］。在奶牛乳腺炎中，前期通過乳腺組織的轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)miR-665在大腸桿菌（E. coli）型乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達(dá)顯著上調(diào)［8］，但是，miR-665在奶牛乳腺炎中的分子作用機(jī)制尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了miR-665在奶牛乳腺炎上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)水平和調(diào)控作用，以期為奶牛乳腺炎的分子調(diào)控機(jī)制解析和分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以實(shí)驗(yàn)室凍存的、經(jīng)鑒定的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。

PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）熒光定量檢測試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司，胰酶消化液、DMEM/F12培養(yǎng)基和PBS緩沖液購自Hyclone公司（美國），胎牛血清購自BI公司（以色列），LPS購自Sigma-Aldrich公司（美國），引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司 合成。

厲新建（1973— ），男，浙江東陽人，博士，北京第二外國語學(xué)院教授，研究方向：旅游經(jīng)濟(jì)發(fā)展戰(zhàn)略、旅游企業(yè)跨國（境）經(jīng)營等。通訊作者。

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及炎癥誘導(dǎo) 將乳腺上皮細(xì)胞解凍后，采用10%胎牛血清的DFEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2濃度和100%飽和濕度的條件下，接種培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞融合至60%-70%時(shí)，利用50 ng/μL LPS誘導(dǎo)細(xì) 胞［17-18］，分別在誘導(dǎo)的0（未處理對照組）、3、6和12 h收集細(xì)胞，用于RNA提取。通過細(xì)胞炎癥因子的qPCR檢測確定炎癥誘導(dǎo)是否成功。

通過不同時(shí)期的三顏色通道分布圖可以看出該菌體不同生長時(shí)期渾濁度的不同帶來的HSV顏色平均值的變化滿足一定的曲線變化規(guī)律，也符合菌體繁殖生長所經(jīng)歷的的遲緩期，對數(shù)期，穩(wěn)定期三個時(shí)期的變化.能給客觀的通過顏色特征值的改變的反應(yīng)培養(yǎng)孔菌體不同生長時(shí)期菌體數(shù)量的變化，能為菌體生長情況的篩選提供依據(jù).

表1 miR-665的逆轉(zhuǎn)錄及qPCR引物Table 1 Reverse transcription and qPCR primers of miR-665

越來越多的研究表明，miRNA是炎癥的重要調(diào)節(jié)因子。在奶牛乳腺炎中許多miRNA已被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不同的作用［12-13，22-23］。同樣，miR-665被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥疾病中發(fā)揮著重要的作用，但其在不同的癌癥中作用不一致，如在人胃癌和卵巢癌中分別靶向蛋白磷酸酶2調(diào)節(jié)亞基（protein phosphatase 2 regulatory subunit Balpha，PPP2R2A）和同源框基因A10（homeobox A10，HOXA10），起到抑制癌癥的作用［24-25］。然而，在乳腺癌中miR-665通過靶向核受體亞家族4A組成員3（nuclear receptor subfamily 4 group A member 3，NR4A3）激活促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［26］。

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫對潛在靶基因的分子功能（molecular function，MF）、生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）進(jìn) 行g(shù)ene ontology（GO）功 能注釋，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以篩選P＜0.05為閾值，綜合確定miR-665的生物學(xué)功能。

1.2.4 miR-665潛在關(guān)鍵靶基因的篩選及其在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)檢測 根據(jù)miR-665的靶基因預(yù)測和KEGG及GO功能注釋結(jié)果，結(jié)合細(xì)胞炎癥相關(guān)信號通路上的關(guān)鍵基因，篩選出絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2，MAP3K2）、SMAD家族成員2（SMAD family member 2，SMAD2）、特 異 性 蛋 白1（specificity protein 1，SP1）共4個炎癥相關(guān)基因。

布萊德先生說：“當(dāng)給予適當(dāng)?shù)臈l件的時(shí)候，人們是很愿意討論死亡的，特別是當(dāng)死亡迫在眉睫的時(shí)候。剛來的人，大都比較緊張，對死亡不了解，不知道自己將怎樣邁向死亡。我們讓他接受冥想訓(xùn)練。其核心就是當(dāng)生命的最后一瞬間，只有你一個人，你將如何走向死亡。這真是一個很有效的訓(xùn)練。當(dāng)反復(fù)訓(xùn)練終于完成之后，病人就不再害怕死亡了。我們把最后的時(shí)刻簡稱為‘在床邊’，因?yàn)樗郎袷窃诖策厧ё呶覀兊?。那種時(shí)候，往往是你一個人。當(dāng)然，我們這里是24小時(shí)都有人值班的，但我們不能保證你‘在床邊’的時(shí)候，旁邊一定會有人。所以，每個人都要練習(xí)獨(dú)自一個人‘在床邊’，在那種時(shí)刻，保持最后的平靜。”

分別以奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)0、3、6和12 h的cDNA為模板，用表2中的引物進(jìn)行上述4個潛在關(guān)鍵靶基因的qPCR檢測，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.2。

表2 miR-665潛在關(guān)鍵靶基因的qPCR引物Table 2 qPCR primers for potential key target genes of miR-665

為探討miR-665在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況，采用qPCR技術(shù)檢測了miR-665在LPS誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞0、3、6和12 h的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與對照組0 h相比，miR-665在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的3、6和12h的表達(dá)量均極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖2）。

2 結(jié)果

2.1 LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)

為進(jìn)一步探討miR-665在乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用，根據(jù)靶基因預(yù)測、KEGG通路、GO功能注釋，結(jié)合主要細(xì)胞炎癥與機(jī)體免疫關(guān)鍵信號通路，初步得到了MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1共4個基因與炎癥和機(jī)體免疫密切相關(guān)。隨后采用qPCR技術(shù)檢測了上述4個基因在LPS誘導(dǎo)的炎性乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量，結(jié)果表明，與對照組（0 h）相比，MAPK14、SMAD2和SP1基因在LPS誘導(dǎo)細(xì)胞3、6和12h的表達(dá)均極顯著下調(diào)（P＜0.01），MAP3K2基因在LPS誘導(dǎo)細(xì)胞6和12 h的表達(dá)極顯著下調(diào)（P＜0.01）（圖7）。值得注意的是，這4個基因與miR-665表達(dá)變化呈相反趨勢。

圖1 主要炎癥因子在LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)Fig.1 Expression of major inflammatory factors in the LPSinduced inflammation of mammary epithelial cells

2.2 miR-665在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律

1.2.5 基因表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)分析 以GAPDH和RPS18為雙內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法［19］分析相對表達(dá)量計(jì)算，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。每個處理進(jìn)行了3個生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。采用SPSS 25.0軟件，通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間的差異表達(dá)顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1）實(shí)驗(yàn)組和對照組總體情況比較。實(shí)驗(yàn)組實(shí)際參與測試的人數(shù)為33名；對照組實(shí)際參與測試的人數(shù)為29名（病假四名）。測試題目有問答題目、聽力測試、認(rèn)讀卡片、背誦兒歌，共100分。從表1可以看出，實(shí)驗(yàn)組在聽說訓(xùn)練等方面的均分均高于測試組。

圖2 miR-665在LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量檢測Fig.2 Expression detection of miR-665 in the LPS-induced mammary epithelial cells

2.3 miR-665的基因定位及保守性分析

應(yīng)用miRBase可知奶牛miR-665位于21號染色體上。另外，對奶牛、人和小鼠等物種的miR-665序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-665在物種間高度保守（圖3），說明牛miR-665可能具有與人、小鼠等其他動物相似的功能。

由于拱棚栽培升溫快，土壤水分蒸發(fā)量大，因此播種時(shí)如底墑不足，最好先澆水再播種，澆水時(shí)應(yīng)逐溝、分段進(jìn)行，注意控制水量和水流速度。

圖3 牛與人、小鼠miR-665的序列對比圖Fig.3 Sequence comparison of miR-665 from bovine，human and mouse

2.4 miR-665靶基因的預(yù)測、GO功能注釋及KEGG通路分析

為探討miR-665的生物學(xué)功能，預(yù)測了miR-665的靶基因。結(jié)果顯示，Target Scan在線工具預(yù)測出2 127個靶基因，miRWalk預(yù)測出1 019個靶基因。二者取交集后共得到了201個潛在靶基因（圖4）。

圖4 miR-665差異表達(dá)的潛在靶基因篩選的韋恩圖Fig.4 Venn diagram for screening potential target genes differentially expressed by miR-665

對MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因 進(jìn) 行保守性分析（表3）。結(jié)果表明，牛MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1與小鼠和人的序列相似性達(dá)84.34%-93.96%，具有較高的保守性，說明以上4個基因在牛與小鼠和人之間具有相似的生物學(xué)功能。

圖5 miR-665潛在靶基因的GO功能注釋結(jié)果Fig.5 GO functional annotation results of miR-665 potential target genes

圖6 miR-665潛在靶基因的KEGG通路分析結(jié)果Fig.6 Results of KEGG pathway analysis of miR-665 potential target genes

2.5 miR-665相關(guān)基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)分析

為證實(shí)炎癥誘導(dǎo)是否成功，本研究采用qPCR技術(shù)，檢測了用LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中主要炎癥因子IL-1β和IL-8的表達(dá)量，結(jié)果表明，與對照組0 h相比，IL-1β和IL-8在LPS誘導(dǎo)的3 h、6 h和12 h的細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)（圖1）。上述結(jié)果證明，LPS成功誘導(dǎo)了奶牛乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。

圖7 miR-665相關(guān)基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表 達(dá)量Fig.7 Expression of miR-665 related genes in the bovine mammary epithelial cell inflammation

2.6 物種間MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因的保守性分析

201個潛在靶基因的GO功能富集發(fā)現(xiàn)，這些基因分子功能主要包含泛素蛋白連接酶活性、G蛋白結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶活性，主要富集在突觸囊泡膜、胞外囊泡膜、細(xì)胞器膜的內(nèi)在成分、突觸小泡、突觸囊泡等，生物學(xué)過程主要為對脂肪酸的反應(yīng)、蛋白質(zhì)去磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)、突觸囊泡周期調(diào)節(jié)、去磷酸化負(fù)調(diào)節(jié)等（圖5）。KEGG通路分析結(jié)果表明，上述基因參與MAPK、心肌細(xì)胞的腎上腺素能信號、癌癥中的蛋白多糖、黏附連接、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、上皮細(xì)胞的細(xì)菌入侵等炎癥反應(yīng)或機(jī)體免疫相關(guān)的信號通路（圖6）。

“共享單車”首例觸犯刑案即是“私藏共享單車”。2016年，上海市閔行區(qū)人民法院對首例共享單車刑案做出一審判決，以盜竊罪判處犯罪人韓某某拘役三個月，緩刑三個月，并處罰金一千元。本案的具體案情為：五十二歲的韓某某因見門口的共享單車幾日無人使用，便想自己占有一輛，于是趁無人注意時(shí)，將車直接搬入自己家中，但因無法開鎖，便擱置家中。

表3 牛與人、小鼠相關(guān)基因的同源性分析結(jié)果Table 3 Homology analysis of related genes in the bovine，human and mouse

3 討論

奶牛乳腺炎是乳腺組織產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量下降［20］。在缺乏有效治療的情況下，使牛奶繁殖力下降，利用年限減少，對牧場造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［21］。E. coli是引起奶牛臨床型乳腺炎最常見的病原微生物之一。LPS是E. coli外膜的主要成分，能夠促使IL-1β和IL-8等炎癥細(xì)胞因子分泌，啟動炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫［20］。乳腺上皮細(xì)胞是識別病原體入侵的第一道防線，是奶牛乳腺免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在LPS誘導(dǎo)后，常常作為乳腺炎研究的細(xì)胞模型［12］。

1.2.2 細(xì)胞RNA提取、主要炎癥因子mRNA及miR-665的RT-qPCR檢測 采用TriZol試劑盒，按照產(chǎn)品說明書提取上述經(jīng)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的總RNA。用電泳和紫外微量分光光度計(jì)檢測RNA的濃度與質(zhì)量。采用Primer Permier 5.0軟件設(shè)計(jì)白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）炎癥因子基因和miR-665的頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物（表1），使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別進(jìn)行miR-665，IL-1β和IL-8炎癥因子mRNA的cDNA合成。以此cDNA為模板，用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）熒光定量檢測試劑盒，在伯樂CFX-96熒光定量PCR儀上檢測miR-665和相關(guān)mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)量。反應(yīng)體系為：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）10 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板1.0 μL，加滅菌去離子水至20 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s共40個循環(huán)，95℃ 10 s，65℃ 5 s。

1.2.3 miR-665的靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)分析 通 過miRBase（http：//www.mirbase.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在 線 工 具 獲 得miR-665的序列、染色體定位等基本信息，并利用DNAman軟件分析物種進(jìn)化保守性。使用Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）和miRWalk （http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）兩種在線軟件預(yù)測miR-665的靶基因，再利用VENNY 2.1在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，最終確定miR-665的潛在靶基因范圍，用于后續(xù)分析。

在奶牛乳腺炎的研究中，迄今為止未見miR-665調(diào)控作用的研究報(bào)道。因此，本研究以LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞為炎癥模型，發(fā)現(xiàn)miR-665在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)不同時(shí)間的表達(dá)量均顯著上調(diào)，與LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺組織炎癥中的測序結(jié)果一致［8］，提示miR-665在奶牛乳腺炎中發(fā)揮著重要的作用。此外，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-665可能調(diào)節(jié)201個潛在靶基因，其中部分靶基因參與的MAPK信號通路、上皮細(xì)胞的細(xì)菌入侵、Th17細(xì)胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、PPAR信號通路、ErbB信號通路等與炎癥的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞的周期和凋亡等具有密切關(guān)系［27-30］。

這樣的生活化操作方式有效激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情，在學(xué)生剪紙完成后教師再加以適當(dāng)?shù)膯栴}引導(dǎo)。比如說計(jì)算學(xué)生這次剪紙過程中所用去的剪紙總量，然后學(xué)生便會運(yùn)用到本課分?jǐn)?shù)加減法的知識點(diǎn)列出算式1/9+1/9+2/9+1/9等于5/9。然后讓學(xué)生利用分?jǐn)?shù)減法對剪紙剩余部分進(jìn)行分?jǐn)?shù)計(jì)算，學(xué)生便會列出1-5/9等于4/9這樣的分?jǐn)?shù)算式。通過這樣的實(shí)踐操作能力，使學(xué)生通過實(shí)踐獲得對知識的深層次理解，學(xué)生在操作過程中便能進(jìn)行對數(shù)學(xué)問題的構(gòu)建，加強(qiáng)對知識的深入思考。在進(jìn)行計(jì)算時(shí)學(xué)生有效地通過實(shí)踐獲得準(zhǔn)確的算式組合，從而得到正確的探究結(jié)論。

值得注意的是，通過生物信息學(xué)和qPCR聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，miR-665可能靶向或間接調(diào)控4個基因，分別為MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1。其中，MAPK14是MAPK蛋白激酶的成員，在炎癥、癌癥及自身免疫中起著關(guān)鍵作用［31］。它可以被趨化因子、氧化應(yīng)激、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、細(xì)菌LPS和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種因子激活［31］。LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中，抑制MAPK14能阻斷MAPK信號通路，阻斷促炎細(xì)胞因子的上調(diào)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷［32］。在LPS誘導(dǎo)的人心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，上調(diào)MAPK14的表達(dá)，能夠加重心肌炎癥和心肌損傷［33］。同樣，MAP3K2也是MAPK信號通路中的上游基因，在炎癥中發(fā)揮著促進(jìn)作用［34］。如在大鼠的心肌梗死中，MAP3K2能夠促進(jìn)炎癥和細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷［35］。Wu等［36］發(fā)現(xiàn)MAP3K2能夠通過腸內(nèi)的輔助性T細(xì)胞1（T helper cell 1，Th1）的介導(dǎo)而加重小鼠結(jié)腸炎；反之，阻斷T細(xì)胞特異性IL-18R-MAP3K2信號通路可以通過抑制Th1細(xì)胞的增殖來減輕小鼠腸道炎癥。本研究中，MAPK14和MAP3K2在乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)量顯著下調(diào)，與miR-665的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，發(fā)現(xiàn)miR-665、MAPK14和MAP3K2在物種間的高度保守，推測miR-665可能通過抑制MAPK14與MAP3K2基因的表達(dá)而緩解乳腺上皮細(xì)胞的炎癥并抑制乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MAP3K2在LPS誘導(dǎo)3 h的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)極顯著上調(diào)，推測MAP3K2的表達(dá)量升高可能是LPS刺激細(xì)胞初期的應(yīng)激反應(yīng)，而在后期表達(dá)量降低，進(jìn)而發(fā)揮對細(xì)胞炎癥的調(diào)節(jié)作用。

SMAD2是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）信號通路中的下游分子，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及自噬等多種生物學(xué)過程，在炎癥的不同時(shí)期發(fā)揮著重要的作用［37-38］。研究表明，在大鼠肝損傷模型中，激活TGF-β1/Smad2信號通路可促進(jìn)敗血癥性肝損傷的發(fā)生［39］。在炎癥引起的肺纖維化中，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和TGF-β/Smad2/3通路的激活能夠阻斷EMT的發(fā)生［40］。此外，Smad2和Smad3在腎臟疾病中被激活，通過TGF-β/Smad和NF-κB的激活加劇腎纖維化和炎癥［41］。Qin等［42］發(fā)現(xiàn)SMAD2基因的敲除對腎毒性和缺血性急性腎損傷小鼠模型的腎損傷、程序化細(xì)胞死亡和腎炎癥均有保護(hù)作用。因此，推測miR-665可能通過負(fù)調(diào)節(jié)SMAD2進(jìn)而減輕奶牛乳腺炎癥。

SP1在乳腺癌、胃癌和肺癌等多種癌癥中過度表達(dá)［43-45］，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡。在炎癥中SP1也發(fā)揮著重要的作用。Wang等［46］發(fā)現(xiàn)miR-29c可能通過直接靶向SP1而減輕帕金森病的炎癥反應(yīng)。此外，通過抑制SP1和NF-κB信號通路的基因治療可能為調(diào)控脂質(zhì)代謝及動脈粥樣硬化相關(guān)炎癥性疾病提供了一個新的靶點(diǎn)［47-48］，表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥中，miR-665也可能靶向SP1發(fā)揮抑炎作用。

綜上所述，miR-665在炎性乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上調(diào)，與潛在靶基因的MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表達(dá)量呈相反趨勢，說明miR-665可能靶向或間接調(diào)控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而緩解乳腺上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)并抑制乳腺上皮細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

奶牛miR-665在LPS誘導(dǎo)炎癥的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)，與潛在靶基因MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表達(dá)量呈顯著相反趨勢；上述基因在牛、人和小鼠中高度保守。miR-665可能靶向或間接調(diào)控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而抑制LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。