趙明明 唐殷 郭磊周 韓佳慧 葛佳茗 孟勇 平淑珍 周正富 王勁

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；2. 綿陽(yáng)禾本生物工程有限公司，綿陽(yáng) 621011）

細(xì)菌面對(duì)外界環(huán)境刺激如干旱、高低溫、鹽脅迫以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的蛋白會(huì)遭受損傷，發(fā)生錯(cuò)誤折疊以及變性聚集，最終造成蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的傷害［1］。為了維持脅迫條件下的生長(zhǎng)和繁殖，細(xì)胞的首要任務(wù)即高效的去除錯(cuò)誤折疊及變性的蛋白，或者幫助錯(cuò)誤折疊蛋白恢復(fù)至天然構(gòu)象，最終使蛋白水平恢復(fù)穩(wěn)態(tài)。在這一過程中，與多種細(xì)胞活性相關(guān)的（ATPases associated with various cellular activities，AAA+）胞內(nèi)水解酶發(fā)揮著重要作用［2］。

Lon蛋白酶是第一個(gè)被純化和研究的AAA+蛋白酶，廣泛存在于細(xì)菌、古菌、真菌以及真核生物的細(xì)胞器中［3］。根據(jù)Lon蛋白酶氨基酸序列的同源性和結(jié)構(gòu)特征，可將Lon蛋白分為兩類，即存在于大部分細(xì)菌中的LonA和主要存在于古細(xì)菌中的LonB。LonA類蛋白酶主要由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別為參與底物識(shí)別的N端結(jié)構(gòu)域、負(fù)責(zé)ATP結(jié)合與水解的ATP酶結(jié)構(gòu)域以及含有Ser-Lys二聯(lián)體的酶活中心。其中ATP酶結(jié)構(gòu)域?yàn)長(zhǎng)on蛋白酶發(fā)揮酶活性提供能量，酶活性中心使Lon具有蛋白水解能力。LonB缺少N端結(jié)構(gòu)域，但是在ATP酶結(jié)構(gòu)域中插入了一段跨膜區(qū)［4］。在水解蛋白質(zhì)的過程中，Lon蛋白酶首先識(shí)別并結(jié)合底物蛋白，再通過ATP的水解使得底物蛋白打開二級(jí)結(jié)構(gòu)，最終底物蛋白以一級(jí)結(jié)構(gòu)的方式被運(yùn)輸?shù)降鞍姿馇恢羞M(jìn)行水解［5］。

Lon蛋白酶的主要功能是水解損傷蛋白。有研究顯示，大腸桿菌中約50%的異常蛋白由Lon負(fù)責(zé)水解，Lon蛋白酶還能通過水解多種調(diào)節(jié)蛋白參與DNA修復(fù)、細(xì)菌毒力、耐藥性、脅迫抗性、形態(tài)等多個(gè)生理學(xué)過程［6］。例如，Jonas等［7］發(fā)現(xiàn)高溫脅迫可誘導(dǎo)新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）Lon蛋白酶的合成，從而水解負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的啟動(dòng)蛋白DnaA，抑制細(xì)菌的DNA復(fù)制，最終提高菌株的高溫脅迫抗性；Lon的缺失使大腸桿菌形成長(zhǎng)線型、不可分裂的細(xì)絲狀表型［8-9］。而Breidenstein等［10］發(fā)現(xiàn)lon基因的突變可影響銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）三型分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而使其毒力減弱。Kim等［11］的研究表明Lon蛋白酶可水解沙門氏菌（Salmonella enterica）鐵離子輸入蛋白FeoC，調(diào)控細(xì)菌在脅迫環(huán)境下鐵離子平衡。

耐輻射異常球菌作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具輻射抗性的微生物之一，具有超強(qiáng)的抵御極端環(huán)境的能力，因此往往作為研究非生物脅迫抗性機(jī)制的模式生物［12-13］。有研究顯示耐輻射異常球菌的極端抗性可歸因于其擁有功能強(qiáng)大的胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)［14］。前期分析發(fā)現(xiàn)高溫脅迫2 h后，耐輻射異常球菌中的編碼Lon蛋白酶同源物的基因dr_1974（lon1）轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，可能在菌株高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究以耐輻射異常球菌的Lon1蛋白酶為研究對(duì)象，通過突變株構(gòu)建、抗逆功能比較、蛋白質(zhì)組分析對(duì)耐輻射異常球菌的Lon1功能進(jìn)行探討，為解析耐輻射異常球菌的極端抗逆機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件 供試菌株和質(zhì)粒見表1。耐輻射異常球菌于TGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。突變株和回補(bǔ)株分別添加相應(yīng)抗生素。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and Plasmids

1.1.2 主要試劑 本實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京聚合美有限公司，常規(guī)質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購(gòu)自Magen公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自Pronega公司，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑及高保真酶2×Phanta Max Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊公司，其它生化試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)涉及的引物合成由生工生物完成，測(cè)序由華大生物技術(shù)公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取lon1的氨基酸序列，使用功能域預(yù)測(cè)網(wǎng)站http：//smart.embl-heidelberg.de/對(duì)Lon1蛋白進(jìn)行功能域分析。通過NCBI進(jìn)行耐輻射異常球菌Lon1同源蛋白的查找，利用ClustalW對(duì)耐輻射異常球菌Lon蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，用NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。并用bootstrap法（重復(fù)1 000次）評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 lon1的轉(zhuǎn)錄水平分析 高溫、氧化、UV和鹽脅迫處理及菌體收集參考劉盈盈［15］方法。提取上述菌體的RNA，并消化反轉(zhuǎn)為cDNA，利用qRTPCR分析lon1在不同非生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平。RNA的提取步驟參考RNA提取試劑盒TRIzolTMPlus RNA Purification Kit說明書，RNA中DNA的去除及反轉(zhuǎn)參考TaKaRa公司的試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進(jìn)行，qRT-PCR程序參考劉盈盈［15］。

1.2.3 lon1突變株及回補(bǔ)株的構(gòu)建 本研究利用同源重組方法在靶標(biāo)基因中插入抗性基因，完成lon1功能缺失突變株構(gòu)建，所用引物如表2。以D. radiodurans R1基因組為模板，用lon1-Up-F/R引物擴(kuò)增lon1的上游序列，用lon1-Down-F/R引物擴(kuò)增lon1的下游序列，以pKatA PH3為模板，用Kan-F/R引物擴(kuò)增帶有啟動(dòng)子的卡納霉素抗性基因片段。通過同源重組將3個(gè)片段進(jìn)行連接，構(gòu)建融合片段Ulon1-Km-Dlon1。利用同源重組的方法轉(zhuǎn)化到D. radiodurans R1野生型中獲得突變株△lon1［16］。擴(kuò)增lon1及上游啟動(dòng)子區(qū)連接pRADZ3載體構(gòu)建重組載體pZ3-lon1，轉(zhuǎn)化至△lon1中，構(gòu)建lon1基因的回補(bǔ)菌株comlon1，同樣的方法將pRADZ3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化△lon1獲得Z3-△lon1。

表2 引物序列Table 2 Sequences of Primers

1.2.4 正常培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)曲線測(cè)定 活化D. radiodurans R1野 生 型、突 變 株△lon1、回 補(bǔ)株comlon1以及Z3-△lon1，將種子液按照起始OD600=0.1分別轉(zhuǎn)接于20 mL新鮮的TGY液體培養(yǎng)基中，于30℃ 220 r/min連續(xù)震蕩培養(yǎng)，期間每隔4 h取樣1次，測(cè)定樣品在OD600時(shí)的吸光值，連續(xù)測(cè)定至細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定后期（約48 h）。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線，每個(gè)菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 蛋白質(zhì)組測(cè)定 活化耐輻射異常球菌野生型WT、△lon1，按1%轉(zhuǎn)接到300 mL新鮮TGY液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)初期（菌液OD600=2）。各取150 mL菌液8 000×g離心10 min收集菌體作為對(duì)照組（CK），將剩余的菌液置于48℃的搖床中220 r/min培養(yǎng)2 h后離心收集菌體作為脅迫處理組。將收集的菌體液氮速凍，利用非標(biāo)定量法（label-free）技術(shù)進(jìn)行蛋白組學(xué)測(cè)定分析。

1.2.6 掃描電鏡與透射電鏡觀察lon1缺失對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 離心收集50 mL OD600=0.6-0.8的菌體，將菌體重懸在2.5%的戊二醛中并室溫固定24 h，然后經(jīng)過一系列漂洗與脫水，最終將菌體包埋在2%的樹脂中并切片，然后用透射電鏡和掃描電鏡觀察不同菌株的形態(tài)。其中透射電鏡為日本HITACH公司的H-7500，掃描電鏡為日本HITACH公司的S-570。

1.2.7 耐輻射異常球菌非生物脅迫實(shí)驗(yàn) 脅迫方法參考1.2.2，脅迫處理完成后用滅菌磷酸緩沖液PBS（pH 7.0）對(duì)進(jìn)行倍比稀釋（10-1-10-5），每個(gè)稀釋度各取8 μL點(diǎn)在固體TGY培養(yǎng)基表面，經(jīng)30℃培養(yǎng)約2-3 d后，觀察菌落形成情況。

2 結(jié)果

2.1 Lon1的生物信息學(xué)分析

Lon1（DR_1974）位于D. radiodurans的I號(hào)染色體上（NC_001263.1），堿基全長(zhǎng)為2 442 bp，編碼 813個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量約為93 kD。功能域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，耐輻射異常球菌的Lon1蛋白酶具有負(fù)責(zé)底物識(shí)別的N端結(jié)構(gòu)域，而無(wú)跨膜區(qū)，具有A類Lon蛋白酶的典型特征（圖1-A），表明耐輻射異常球菌的Lon1蛋白為A類Lon蛋白酶。

將Lon1的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行比對(duì)BlastP搜索，并選取具有代表性的細(xì)菌的Lon氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖1-B所示，除Deinococcus屬以外，耐輻射異常球菌Lon1與Marinithermus hydrothermalis的親緣關(guān)系較近。

圖1 Lon1結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Structural domain and phylogenetic analysis of Lon1

2.2 lon1的轉(zhuǎn)錄受高溫誘導(dǎo)

為了研究不同非生物脅迫條件下耐輻射異常球菌野生型菌株中l(wèi)on1基因的表達(dá)情況，本研究通過qRT-PCR分析了在高溫脅迫（48℃）、UV輻射、鹽脅迫以及過氧化氫脅迫條件下lon1轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果如圖2所示，48℃高溫沖擊不同時(shí)間（1、2、3、4和5 h），lon1（dr_1974）的轉(zhuǎn)錄水平量均顯著提高，其中在沖擊3 h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)倍數(shù)最高，約上調(diào)了27倍，隨著沖擊時(shí)間的延長(zhǎng)，lon1的轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降直至恢復(fù)至沖擊前水平（圖2-A）。同時(shí)分析了lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄變化，結(jié)果顯示相較于高溫脅迫，lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平變化倍數(shù)較小（圖2-B、C、D）。以上結(jié)果說明lon1受高溫脅迫誘導(dǎo)，可能在耐輻射常球菌的高溫脅迫適應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

圖2 熒光定量PCR分析不同脅迫條件下lon1基因的轉(zhuǎn)錄變化Fig. 2 Transcriptional analysis of lon1 gene under different stress conditions by qRT-PCR

2.3 lon1突變株及回補(bǔ)株的構(gòu)建及驗(yàn)證

通過同源重組技術(shù)獲得lon1基因上游、卡那霉素抗性盒及l(fā)on1基因下游3個(gè)片段的融合產(chǎn)物lon1 U-Kan-D，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后熱擊轉(zhuǎn)化至耐輻射異常球菌野生型中。在含有卡那霉素的平板上篩選陽(yáng)性克隆，并利用PCR擴(kuò)增與測(cè)序驗(yàn)證獲得正確的突變株△lon1，通過qRT-PCR測(cè)定了lon1基因缺失對(duì)上下游基因轉(zhuǎn)錄的影響。從圖3-A中可以看出，lon1基因上游為clpP和clPX基因，分別編碼AAA+蛋白酶ClpXP的兩個(gè)亞基，ClpXP蛋白酶也是細(xì)胞水解系統(tǒng)的重要組成部分；lon1下游的dr_1975和dr_1976分別編碼N-乙?；D(zhuǎn)移酶和核酸內(nèi)切酶；從圖3-C中可以看出，lon1的缺失對(duì)其上下游基因的轉(zhuǎn)錄無(wú)影響。在此基礎(chǔ)上通過構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化△lon1的方式獲得回補(bǔ)株comlon1和對(duì)照菌株Z3-△lon1。正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線測(cè)定（圖4）發(fā)現(xiàn)，lon1的缺失和回補(bǔ)以及pRADZ3質(zhì)粒均不影響耐輻射異常球菌的生長(zhǎng)。

圖3 lon1突變株的構(gòu)建與驗(yàn)證Fig. 3 Construction and identification of the lon1 mutant strain

圖4 正常培養(yǎng)條件下菌株D. radiodurans、△lon1、com lon1和Z3-△lon1的生長(zhǎng)Fig. 4 Growth of D. radiodurans，△lon1，com lon1 and Z3-△lon1 in normal culture condition

2.4 lon1的缺失導(dǎo)致菌株對(duì)高溫和鹽脅迫敏感

為了確定lon1基因是否與耐輻射異常球菌響應(yīng)極端環(huán)境有關(guān)，分析了耐輻射異常球菌野生型R1、突變株△lon1和回補(bǔ)株comlon1在48℃高溫脅迫、NaCl脅迫、UV輻射以及不同濃度過氧化氫處理30 min條件下的生長(zhǎng)情況。結(jié)果（圖5）顯示，相較于野生型菌株R1，48℃高溫脅迫5 h使△lon1的存活率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)，且lon1的回補(bǔ)能夠使菌株恢復(fù)至與野生型同樣的生長(zhǎng)狀態(tài)，這說明lon1與耐輻射異常球菌的高溫脅迫抗性相關(guān)；除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)0.2 mol/L的NaCl脅迫條件下，菌株△lon1的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，其存活率比野生型降低約4個(gè)數(shù)量級(jí)，因此lon1在耐輻射異常球菌的鹽脅迫下發(fā)揮更為重要作用。但在過氧化氫脅迫及UV脅迫條件下，△lon1的存活并未受到嚴(yán)重影響，其生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型菌株相比未見巨大差異。

圖5 高溫、NaCl、H2O2以及UV脅迫對(duì)不同菌株生長(zhǎng)的影響Fig. 5 Growth of different strains upon high temperature，NaCl，H2O2 and UV stresses

2.5 高溫脅迫條件下耐輻射異常球菌野生型及△lon1的蛋白組分析

48℃脅迫2 h 后，相較于野生型菌株，△lon1中共有31個(gè)蛋白發(fā)生顯著差異，其中25個(gè)蛋白表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)（P＜0.05，F(xiàn)C＞1.5），6個(gè)蛋白水平發(fā)生顯著下調(diào)（P＜0.05，F(xiàn)C＜0.667）。如表3所示，顯著上調(diào)表達(dá)的蛋白主要包括分子伴侶DnaK、GroEL、ClpB、GroS、GrpE，此外參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝以及膜功能和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白表達(dá)量也發(fā)生了顯著上調(diào)，而參與氨基酸代謝和翻譯的相關(guān)蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。值得注意的是，5個(gè)與細(xì)胞形態(tài)建成相關(guān)的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，這說明在響應(yīng)高溫脅迫的過程中，Lon1 參與一個(gè)廣泛的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，且Lon1可能與耐輻射異常球菌的細(xì)胞形態(tài)相關(guān)。

表3 與lon1有關(guān)的響應(yīng)高溫脅迫的差異表達(dá)蛋白Table 3 Differentially expressed proteins associated with lon1 in response to high temperature stress

2.6 Lon1的缺失影響菌株的細(xì)胞形態(tài)

由于蛋白組數(shù)據(jù)顯示正常生長(zhǎng)條件下lon1基因缺失使5個(gè)細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的蛋白發(fā)生差異表達(dá)，本研究利用掃描電鏡和透射電鏡觀察野生型菌株DR、△lon1以及comlon1的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖6所示，從圖6-A中可以看出lon1基因缺失后，耐輻射異常球菌的細(xì)胞形態(tài)異常，不再呈典型的四分體或二分體結(jié)構(gòu)，而是呈串狀聚集，并且中間黑色的肽聚糖層顯著變薄，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯損傷，細(xì)胞外膜出現(xiàn)彌散，有碎片物質(zhì)從細(xì)胞表面分離。圖6-B掃描電鏡結(jié)果顯示突變株△lon1的細(xì)胞體積顯著大于野生型細(xì)胞，形成巨型細(xì)胞且lon1的缺失使其向細(xì)胞表面分泌大量物質(zhì)，而lon1基因的回補(bǔ)能夠使菌株恢復(fù)正常的形態(tài)。從以上結(jié)果可以看出，在耐輻射異常球菌中，lon1參與細(xì)胞形態(tài)以及分裂過程。

圖6 耐輻射異常球菌野生型DR、△lon1以及comlon1的電鏡圖Fig. 6 Electron microscopy images of WT D. radiodurans DR，△lon1 and comlon1

3 討論

耐輻射異常球菌能夠在多種極端環(huán)境下存活的原因是能夠在脅迫條件下最大程度維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)［13］。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的研究顯示耐輻射異常球菌的蛋白水解酶種類豐富且水解活性 強(qiáng)［14，17］。Lon作為一種重要的蛋白水解酶，在多種細(xì)菌脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。耐輻射異常球菌dr_1974（lon1）基因編碼一個(gè)Lon蛋白酶同源物，進(jìn)化分析顯示除了Deinococcus外，Lon1與嗜熱菌的親緣關(guān)系最近。此外qRT-PCR結(jié)果顯示lon1的轉(zhuǎn)錄受高溫誘導(dǎo)。高溫主要造成蛋白質(zhì)變性損傷，但由于細(xì)胞本身并不能識(shí)別溫度的變化，因此高溫脅迫響應(yīng)往往是由損傷蛋白的聚集所觸發(fā)的［18］，因此Lon蛋白酶表達(dá)受到高溫脅迫調(diào)控極有可能是適應(yīng)高溫的進(jìn)化結(jié)果。以上結(jié)果說明耐輻射異常球菌 Lon1可能在高溫脅迫中發(fā)揮作用。

在遭受高溫等非生物脅迫時(shí)，細(xì)胞除了利用胞內(nèi)蛋白水解酶高效的清除變性受損蛋白外，同時(shí)也會(huì)通過分子伴侶蛋白對(duì)變性受損以及錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)行選擇性修復(fù)［19］。分子伴侶多為熱休克蛋白，高溫可誘導(dǎo)其大量表達(dá)，其主要功能是幫助蛋白恢復(fù)至天然構(gòu)象［20］，因此分子伴侶同樣是維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要組成部分。高溫條件下蛋白組結(jié)果顯示，lon1的缺失引起多個(gè)分子伴侶蛋白含量顯著升高，說明這些分子伴侶受高溫誘導(dǎo)大量表達(dá)，同時(shí)這些分子伴侶可能是Lon1的水解底物，lon1的缺失影響了這些分子伴侶的水解，因此表現(xiàn)為表達(dá)量的顯著上調(diào)。除此之外，Lon蛋白酶可能通過水解多種天然調(diào)控蛋白參與多個(gè)生物學(xué)過程［6］，本研究的蛋白組結(jié)果顯示，lon1的缺失使DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及膜功能與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)等。這說明高溫脅迫條件下耐輻射異常球菌Lon1參與一個(gè)廣泛的蛋白調(diào)控網(wǎng)。

lon基因突變還會(huì)導(dǎo)致多種表型，例如大腸桿菌（E.coli）和根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）lon的缺失使菌體呈長(zhǎng)線型且對(duì)紫外敏感［8，21］；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）lon的缺失造成細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力明顯缺陷，分裂過程異常［22］。透射電鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，lon1的缺失使耐輻射異常球菌分裂異常，不再呈現(xiàn)典型的四分體或二分體結(jié)構(gòu)，而是以串狀形式聚集，形成巨型細(xì)胞，并且細(xì)胞膜受損嚴(yán)重。蛋白組差異蛋白中的細(xì)胞形態(tài)相關(guān)蛋白MurB、MurC、MurD、MurE都是細(xì)胞膜組分肽聚糖合成途徑中的關(guān)鍵酶［23］，這可能是lon1的缺失使細(xì)胞膜完整性下降的主要原因，而lon1的缺失使耐輻射異常球菌對(duì)NaCl敏感則可能是細(xì)胞膜受損造成的。

對(duì)于Lon蛋白酶缺失造成的細(xì)胞分裂異常也有諸多報(bào)導(dǎo)，文獻(xiàn)顯示大部分細(xì)菌細(xì)胞分裂受抑制基因sulA的調(diào)控，該基因的產(chǎn)物可以抑制細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白FtsZ的表達(dá)來阻止細(xì)胞分裂，以防止母細(xì)胞的染色體畸變遺傳［24］。進(jìn)一步的研究顯示SulA蛋白為L(zhǎng)on的底物，在正常生長(zhǎng)條件下，SulA的表達(dá)受到抑制，且SulA可被Lon正常降解［25］，其胞質(zhì)濃度很低。當(dāng)非生物脅迫造成DNA損傷時(shí)，可誘導(dǎo)SulA的表達(dá)，其胞質(zhì)濃度顯著增加。此時(shí)，SulA通過與FtsZ結(jié)合阻止細(xì)胞分裂，在DNA修復(fù)后，Lon水解SulA使其胞質(zhì)濃度恢復(fù)至正常水平，細(xì)胞分裂逐漸恢復(fù)正常［4］。因此在Lon缺失條件下，SulA濃度將會(huì)長(zhǎng)期處于較高水平進(jìn)而影響細(xì)胞分裂。本研究中l(wèi)on1的缺失雖然使細(xì)胞分裂出現(xiàn)了異常，但同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌中并沒有SulA同源物，因此耐輻射異常球菌Lon參與細(xì)胞分裂的途徑還需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

耐輻射異常球菌lon1的轉(zhuǎn)錄受高溫誘導(dǎo)，在響應(yīng)高溫脅迫的過程中參與DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、膜功能與代謝等多個(gè)生物學(xué)過程。除此之外，lon1的缺失雖不影響菌株的生長(zhǎng)，但卻使細(xì)胞分裂異常，形成巨型細(xì)胞，細(xì)胞膜受損嚴(yán)重。lon1的缺失使耐輻射異常球菌對(duì)高溫脅迫和鹽脅迫敏感。