薛鮮麗 王靜然 畢杭杭 王德培，2

（1. 天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉移酶（SAGA）復合體是一種多蛋白復合物，是一個多亞基保守的轉錄輔助因子，主要負責體內10%以上的基因轉錄［1］。Spt7是構成 SAGA 復合物的核心結構之一，維持 SAGA 復合物的穩(wěn)定。其含有至少一個保守結構域，參與生物體轉錄調控，例如Bromo結構域，可以結合乙?；嚢彼幔?-3］。SAGA作為一類多功能蛋白復合體，通過對組蛋白進行乙?；?］和去泛素化［5］修飾，實現染色質結構在沉默和活躍狀態(tài)之間的轉換，為基因轉錄起始創(chuàng)造了合適的遺傳條件；另外它通過與轉錄激活因子以及RNA 聚合酶 II等結合，幫助將它們募集到靶基因的啟動子區(qū)域發(fā)揮作用；除此之外它還參與到DNA損傷修復、mRNA輸出［6-8］等多種生物學過程。

目前發(fā)現 SAGA 復合體由至少 20 個蛋白組成［9］，以酵母SAGA復合物為例，它是由20個亞基組成，在結構上可分為4個不同的模塊：由Ubp8、Sgf11、Sgf73和Sus1組成的雙歧化（DUB）模塊，由Gcn5、Ada2、Ada3和Sgf29組成組蛋白乙酰轉移酶（HAT）模塊，TATA結合蛋白（TBP）相關因子（TAF）模塊，以及由Spt3、Spt8、Tra1、Spt20、Spt7和Ada1組成Ty（SPT）模塊。SAGA復合體的完整性主要依賴核心組件Spt7、Spt20和Ada1三個亞基，其中SPT模塊與SAGA復合體的招募有關。研究發(fā)現Spt7參與調節(jié)Spt20和Ada1的水平，并且含有Spt7的部分SAGA復合物可以在Spt20和Ada1都不存在的情況下組裝［10］。Spt7最初被發(fā)現是通過在釀酒酵母HIS4和LYS2基因的5'非編碼區(qū)的δ 插入突變以及Ty表型的影響［11］，后來發(fā)現spt7編碼一種定位于細胞核的大型酸性蛋白質，缺失spt7基因的細胞可以存活，但生長緩慢，并呈現多種表型如肌醇營養(yǎng)不良、細胞形態(tài)發(fā)生改變、產孢缺陷以及Ty元素的轉錄改變［12］等。最新研究發(fā)現來自釀酒酵母的SAGA復合物核心是Taf5、Sgf73和Spt20亞基和組蛋白八聚體樣折疊［13-14］，八具體折疊中還包含了異二聚體Taf6-Taf9、Taf10-Spt7和Taf12-Ada1，以及Spt3中的兩個組蛋白折疊結構域。

SAGA 復合體在真核生物中高度保守，釀酒酵母中 SAGA 復合物各亞基的同源蛋白已在果蠅、植物與人中得到鑒定［15-19］。雖然 SAGA 復合體三維結構在酵母與人體細胞中高度相似，但研究發(fā)現SAGA 復合體在不同物種中發(fā)揮的功能存在差異性。迄今為止，黑曲霉乃至絲狀真菌范疇中均未見有關Spt7的報道。本實驗過程中意外的發(fā)現spt7基因缺失使菌株與原始菌株黑曲霉的菌落形態(tài)大相徑庭。與原始菌株相比，Δspt7菌株菌絲頂端膨大、菌絲短小、粗細不均勻，且部分區(qū)域出現類似酵母的念珠狀結構，不生成分生孢子。且spt7基因的缺失無法通過添加外源碳源得到彌補。從文獻得知此基因是 SAGA 復合物結構穩(wěn)定核心亞基之一，其缺失可能使 SAGA 復合體失活，從而影響黑曲霉菌體生長發(fā)育及分生孢子形成關鍵性基因的轉錄表達。為了進一步驗證Spt7的功能，本研究構建一株過表達Spt7的菌株，對其生長形態(tài)、分生孢子形成、抗氧化脅迫、高溫及高滲耐受性等進行觀察分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑曲霉（Aspergillus niger 1062）由江蘇國信協聯能源有限公司天津分公司保藏。大腸桿菌DH5α和根癌農桿菌AGL1采購于中國普通微生物菌株保藏管理中心，由天津科技大學生物工程學院生化過程與技術研究室保藏。

1.1.2 試劑 無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨采購自天津市北方天醫(yī)試劑公司，硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二甲、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、五水合硫酸銅、硫酸錳、硼酸、七水合硫酸鋅、六水合氯化鈷、苯酚、氯仿、冰乙酸、甲醇、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水乙醇、甘油、乙酰丁香酮、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素、卡那霉素、潮霉素（均為分析純）采購自北京市索來寶科技有限公司，DL5000 DNA Maker、快速 DNA 聚合酶（5 U/μL）采購自南京諾唯贊生物科技有限公司，T4-DNA連接酶（10 U/μL），限制性內切酶 BamH I（15 U/μL）采購自寶日醫(yī)生物技術有限公司，真菌RNA提取試劑盒（50T）采購自北京酷來博科技有限公司，RNA反轉錄試劑盒HiS cript III RT Super Mix for qPCR（+Gdna wiper）（100rxn）采購自南京諾唯贊生物科技有限公司，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（500 rxns）采購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1% NaCl，0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨；大腸桿菌感受態(tài)轉化篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加（0.01%）卡那霉素；電轉根癌農桿菌篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加0.012%卡那霉素；CM培養(yǎng)基：ASP+N-母液2%、葡萄糖1%、1 mol/L MgSO4母液0.2%、CM Trace elements 0.1%、酪蛋白水解物0.1%、酵母浸出物0.5%（ASP+N-母液：氯化鉀2.61%、磷酸二氫鉀7.48%、硝酸鈉29.75%、氫氧化鉀調節(jié)pH至5.5；CM Trace elements：七水合硫酸鋅2.1%、硼酸1.1%、四水合氯化錳0.5%、七水合硫酸亞鐵0.5%、四水合氯化鈷0.17%、五水合硫酸銅0.16%、二水合鉬酸鈉0.15%、EDTA5.1%）；根癌農桿菌介導的轉化初步篩選培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基外源添加0.01%氨芐青霉素、0.008%頭孢噻肟鈉和0.015%潮霉素；根癌農桿菌介導的轉化初步篩選培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基添加0.025%潮霉素；農桿菌轉化所用 IM 培養(yǎng)基參照文獻［20］配制；提RNA 所用培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%酵母粉，0.2%磷酸二氫鉀，0.2%硫酸鎂。

1.1.4 儀器與設備 LRH-250A生化培養(yǎng)箱采購自韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司，WXL-A30002電子天平采購自北京賽多利斯儀器系統有限公司，LDZX-50FB 立式壓力蒸汽滅菌器采購自上海申安醫(yī)療器械廠，ChampGel5000全自動凝膠成像儀采購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，Eppendorf PCR儀采購自上海恒久醫(yī)療器械有限公司，CX23 型光學顯微鏡采購自OLYMPUS 公司，實時熒光定量PCR儀（Stepone Plus）采購自美國ABI公司，由天津科技大學生物學院分析測試中心保存。

1.2 方法

1.2.1 Spt7同源序列分析及進化樹的構建 根據 GenBank中登錄的相關Aspergillus niger CGMCC 10142中spt7序列，采用NCBI比對后獲得的Spt7的同源氨基酸序列。選取釀酒酵母及黑曲霉中的Spt7蛋白序列在SMART網址進行比對分析其內部結構。選取序列Aspergillus niger CBS 513.88來源的轉錄激活因子Spt7（XP 001399796.1），Aspergillus sclerotioniger CBS 115572來源的溴結構域 蛋 白（bromodomain protein）（XP 025466510.1），Aspergillus saccharolyticus JOP 1030-1來源的組蛋白乙酰轉移酶SAGA/ADA 催化亞基PCAF/GCN5（XP 025427320.1），Penicilliopsis zonata CBS 506.65來源的假定蛋白ASPZODRAFT 127728（XP 022586128.1），Byssochlamys spectabilis No. 5來源的溴結構域蛋白（GAD99092.1），Monascus purpureus來源的轉錄激活因子Spt7（TQB67779.1），用MEGA7.0.26軟件構建Spt7氨基酸序列系統進化樹。

1.2.2 spt7過表達質粒pOE spt7的構建 pOE spt7質粒即p66-PglaA-spt7的構建：以p66質粒為出發(fā)質粒，選用BamH I進行單酶切線性化，A. niger 1062基因組為模板，分別通過引物spt7-F和spt7-R（含終止子）、引物Pgla-F和Pgla-R擴增片段片段spt7和pgla；將片段pgla和片段spt7通過Over-lap PCR的方法融合成一個片段pgla-spt7。通過重組酶進行連接獲得質粒pOE spt7，并熱激轉化至大腸桿菌。以大腸桿菌菌液為模板驗證pOE spt7質粒。本研究所用引物均由金唯智生物科技公司合成，如表1 所示。

表1 試驗中用到引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.3 農桿菌轉化黑曲霉及過表達spt7陽性轉化子的篩選 將pOE spt7質粒電轉化農桿菌 AGL1 感受態(tài)細胞，并以菌液為模板驗證農桿菌。按照文獻所述方法孵育農桿菌［21］，之后將農桿菌與黑曲霉新鮮孢子置于 IM 固體培養(yǎng)基硝酸纖維膜上，25℃避光共培養(yǎng) 48 h。待共培養(yǎng)過后用無菌生理鹽水將黑曲霉孢子從膜上洗到篩選培養(yǎng)基，37℃黑暗培養(yǎng) 2-3 d。待初篩版上長出白色單菌落后，挑單菌落進行復篩驗證。

1.2.4 OE spt7轉化子菌落、菌絲觀察及分生孢子計數 將OE spt7轉化子及出發(fā)菌株同時接種到CM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d，取爬片顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；對菌落孢子數進行計數：用直徑 20 mmol/L 的打孔器從菌落中心打孔采樣，將孢子用 1 mL 無菌水洗下，血球計數板計數，進行產孢量分析。

1.2.5 OE spt7菌株抗氧化脅迫性觀察 將OE spt7轉化子及出發(fā)菌株同時接種到含有6 mmol/L H2O2、15 mmol/L H2O2的CM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長情況。

1.2.6 OE spt7轉化子高溫、高滲抗逆性實驗 將OE spt7轉化子及出發(fā)菌株同時接種到含有15% NaCl的CM培養(yǎng)基中，置于30℃下培養(yǎng)9 d，觀察菌落生長狀況。

將對照組與OE spt7轉化子點種在CM培養(yǎng)基上，置于39℃下培養(yǎng)，觀察1-4 d菌落生長形態(tài)。

1.2.7 OE spt7菌株RNA提取及過氧化物酶及熱休克蛋白轉錄水平 將OE spt7菌株及對照組的孢子置于含有15 mmol/L H2O2的CM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h，參考真菌RNA提取試劑盒說明書提取RNA，經反轉錄后進行qRT-PCR。目前在生物體內常見的抗氧化酶有過氧化氫酶（catalase，CAT），超氧化物歧化酶Orgotein（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），過氧化氫酶過氧化物酶編碼基因（catalase-peroxidaseencoding gene，CpeB）。

選取熱休克蛋白家族中的Hsp40、Hsp70、Hsp90蛋白進行轉錄水平的檢測。將OE spt7菌株及對照組的孢子置于CM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后在置于42℃水浴分別熱處理3 h和5 h，提取RNA，經反轉錄后進行qRT-PCR。

qRT-PCR方法及操作步驟參考 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行，所使用的引物如表1所示。

2 結果

2.1 Spt7氨基酸序列比對及遺傳進化樹分析

目前關于以Spt7為核心組分的SAGA復合物的研究僅集中在酵母、果蠅、人、植物細胞內，不同物種的Spt7氨基酸相似性極低，但結構相似，如圖1-A所示，在黑曲霉與釀酒酵母的Spt7序列中，都含有溴結構域，但是溴結構域所在位點不同。本研究中黑曲霉和釀酒酵母Spt7多肽鏈全長分別含有1 175和1 332個氨基酸殘基，二者Spt7氨基酸多序列比對結果如圖1-B所示，相似性僅有21.96%。將不同絲狀真菌來源的Spt7的氨基酸序列比對后構建進化樹如圖1-C所示，結果發(fā)現黑曲霉Spt7與曲霉菌A. sclerotioniger的溴域蛋白處于同一分支，通過文獻查找發(fā)現1995年報道了一篇關于酵母的Spt7，它是一個含有溴結構域的酸性蛋白，推測在曲霉菌中Spt7同樣含有溴結構域。同時與糖曲霉A. saccharolyticus JOP 1030組蛋白乙酰轉移酶SAGA/ADA催化亞基PCAF/GCN5也有較近的親緣關系。曲霉菌與帶狀青霉P. zonata CBS 506.6的假定蛋白分別處于一分支。與絲衣霉B. spectabilis No. 5的溴域蛋白及紫色紅曲M. purpureus的轉錄活性因子Spt7的親緣關系較遠。

2.2 Spt7對絲狀真菌菌絲形態(tài)及分生孢子形成的影響

將轉化子與對照組孢子點種在CM培養(yǎng)基上觀察3 d，結果如圖2-A所示，對照組與轉化子的菌落大小無明顯區(qū)別，兩菌株整體呈棕色，菌落中間有大量棕色孢子，邊緣菌絲呈乳黃色；與對照組菌株相比，轉化子菌落中間褶皺更深，有更多凸起，而對照組菌株較為平整。第2天對照組產孢比轉化子多但是轉化子菌絲更加茂密，而到第3天轉化子的孢子產量（數值）明顯比對照組高（數值）（圖2-B），3個轉化子的孢子數量分別是5.8×107/cm2、6.2×107/cm2、6.3×107/cm2比對照組2.3×107/cm2高了2.5-2.7倍。說明過表達spt7基因使菌體產孢延遲，但是增加了孢子產量。為了進一步觀察過表達spt7對菌體菌絲的影響，通過制備爬片并在顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，如圖2-C所示，對照菌株菌絲相對疏松，枝節(jié)細長且直，轉化子菌株菌絲稠密，枝節(jié)較多且短而粗。

圖2 30℃下對照組及轉化子的生長形態(tài)觀察及孢子計數Fig. 2 Growth morphology observation and spore count of control and transformants at 30℃

2.3 OE spt7菌株抗氧化脅迫性分析

氧化脅迫的產生是由于胞內活性氧含量過高，使得胞內氧化還原的狀態(tài)失衡，進而引起菌體一系列應激反應，菌體通過激活相關基因的表達來降解活性氧從而修復和維持細胞的動態(tài)平衡。為探究Spt7對黑曲霉氧化耐受的影響，分別測定6 mmol/L H2O2以及15 mmol/L H2O2脅迫下，黑曲霉對照組及OE spt7菌株的生長情況。如圖3 所示，在6 mmol/L H2O2上對照組延遲24 h萌發(fā)，但在后期4-5 d時生長情況與轉化子無明顯差異。在15 mmol/L H2O2的CM培養(yǎng)基上，對照組孢子延遲萌發(fā)且萌發(fā)后菌落生長受到抑制，菌落直徑明顯小于轉化子，充分說明了過表達Spt7可以提高菌株的抗氧化脅迫能力。通過轉化子對H2O2的抗逆性觀察實驗發(fā)現過表達Spt7增加了菌體對的H2O2耐受性。

圖3 對照組及OE spt7轉化子在含有不同濃度H2O2 CM培養(yǎng)基的生長情況Fig. 3 Growths of control group and OE spt7 transformants in CM medium containing different concentrations of H2O2

2.4 OE spt7菌株高滲耐受性分析

本研究進一步驗證OE spt7轉化子對其他不良環(huán)境的耐受性，于是將轉化子與對照組孢子點種在含有15% NaCl的CM培養(yǎng)基上進行9 d的觀察實驗，結果如圖4所示。從整體來看，對照組與轉化子都能在高鹽板上萌發(fā)及生長，但是萌發(fā)都受到抑制，對照組受抑制較為明顯。轉化子在第2天即可看到孢子的萌發(fā)跡象，但對照組則是在第3天開始出現氣生菌絲，隨后較轉化子均生長緩慢，菌體顏色偏灰白色；從第3-5天的生長情況觀察，發(fā)現轉化子的氣生菌絲明顯比對照組稀少，但在培養(yǎng)6 d后氣生菌絲忽然增加，并且隨著菌落的生長，氣生菌絲也越來茂密；在菌體生長的7-9 d，轉化子的生長明顯比對照組快，且菌落顏色相對對照組更加嫩黃，菌體更加鮮活。說明過表達Spt7可以提高菌株對高滲不良環(huán)境的耐受能力。

圖4 對照組及OE spt7轉化子在含有15%NaCl的CM培養(yǎng)基生長情況Fig. 4 Growths of control group and OE spt7 transformants in CM medium containing 15% NaCl

2.5 OE spt7菌株高溫耐受性分析

將對照組與OE spt7轉化子點種在CM培養(yǎng)基上，置于39℃下培養(yǎng)，觀察1-4 d菌落生長形態(tài)，結果如圖5所示，對照組與轉化子在39℃孢子均能萌發(fā)，較最適溫度30℃相比生長緩慢，與對照組相比轉化子孢子萌發(fā)更快、生長狀態(tài)良好且菌落依然飽滿，但是對照組在后期不僅生長相對緩慢且菌落干癟、失水嚴重。

圖5 對照組及OE spt7轉化子在39℃高溫下生長情況Fig. 5 Growths of control group and OE spt7 transformants at 39℃ of high temperature

2.6 過氧化物酶qRT-PCR結果

從表征觀察發(fā)現過表達Spt7后，菌株的抗氧化能力提高，于是對轉化子及對照組通過qRT-PCR分析關鍵性的過氧化物酶的轉錄水平，結果如圖6所示，可以看出在含有H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化子與對照組，過表達Spt7使spt7的轉錄水平上調2.15倍；同時超氧化物歧化酶SOD轉錄水平相對對照組上調了3.8倍，谷胱甘肽過氧化物酶GPX以及過氧化氫酶-過氧化物酶CepB編碼基因的轉錄也上調了1.89倍；但是對于過氧化氫酶CatR的轉錄下調了3.56倍。

圖6 對照組及OE spt7轉化子抗氧化物酶的轉錄水平Fig. 6 Transcript levels of antioxidant enzymes in the control and OE spt7 transformants

2.7 熱休克蛋白qRT-PCR結果

因OE spt7轉化子在高溫下生狀態(tài)良好，因此推測其內部熱休克蛋白發(fā)揮作用。將其與對照組分別熱激3 h與5 h后，qRT-PCR驗證其熱休克蛋白的轉錄水平。如圖7-A所示，熱激3 h后，OE spt7轉化子Spt7的轉錄水平相對對照組上調了1.92倍，OE spt7轉化子的熱休克蛋白Hsp40、Hsp70、Hsp90相比對照組分別下調了0.9、0.1、0.5倍，但OE spt7轉化子與對照組熱休克蛋白轉錄水平并未呈現出顯著差異性。為了進一步觀察熱休克蛋白的轉錄情況，作者將熱激時間延長到5 h，較熱激3 h結果相比，OE spt7轉化子與對照組Spt7、Hsp40及Hsp70的轉錄水平沒有差異性，但OE spt7轉化子Hsp90轉錄水平較對照組上調了19倍（圖7-B）。

圖7 對照組及OE spt7轉化子在42℃熱激條件下胞內熱休克蛋白的轉錄水平Fig. 7 Transcript levels of intracellular heat shock proteins in the control and OE spt7 transformants under heat stress conditions at 42℃

3 討論

3.1 Spt7同源序列分析結果及蛋白結構域分析

系統進化樹分析發(fā)現，不同菌種中Spt7的氨基酸序列差別很大，黑曲霉與釀酒酵母的Spt7氨基酸序列比對后只有21.9%的相似性，說明在不同物種間，Spt7同源性較低。通過與釀酒酵母的Spt7蛋白結構比較，發(fā)現兩菌種中的Spt7都含有溴結構域，只是結構域所在位點不同。而溴結構域本身是一種能識別乙?；嚢彼釟埢牡鞍捉Y構域。有些學者認為溴結構域作為調節(jié)蛋白可以直接識別組蛋白中乙?；馁嚢彼?，從而被乙?；慕M蛋白募集。在轉錄調控中，啟動子可以通過溴結構域蛋白判斷許多的關鍵的調節(jié)因子是否存在，從而決定相關基因的表達或者沉默［22］。目前已經鑒定出大量含有溴結構域的調節(jié)蛋白。并且關于溴結構域的功能還未完全發(fā)現，而溴結構域作為Spt7蛋白結構的主要結構域，其在Spt7相關功能中可能起到主要作用。

3.2 過表達spt7對菌體表征的影響

通過與原始菌株的形態(tài)觀察比較，從整體來看，菌體形態(tài)并無太大區(qū)別，但是在生長過程中，轉化子與對照組在產生分生孢子前，轉化子的菌絲更加茂密，進一步用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，發(fā)現菌絲分枝增多。但是菌體產孢延遲說明過表達spt7對菌體生長繁殖十分有利，并且在產孢期，轉化子的孢子數量明顯提高是對照組的2-3倍，通過以上現象我們推測spt7可能是菌體生長繁殖的關鍵基因。研究發(fā)現Spt7基因的缺失導致釀酒酵母生長緩慢且Ty、INO1、MFA1等基因的轉錄受到抑制［10-12］，且本課題組獲得的一株缺失Spt7基因的高產檸檬酸黑曲霉菌落聚縮生長、不產分生孢子以及無法正常產酸，總之Spt7是酵母細胞、黑曲霉生長很重要的核蛋白，對 RNA 聚合酶轉錄的某些基因的表達有關鍵性的調控作用。

3.3 OE spt7菌體對不良環(huán)境的抗逆性分析

過氧化氫作為強氧化劑損耗細胞內抗氧化物質，使細胞抗氧化能力低下，進而引起細胞衰亡。過表達spt7轉化子菌體在高濃度過氧化氫環(huán)境培養(yǎng)后，發(fā)現轉化子的生長幾乎不受過氧化氫的影響，推測Spt7參與了抗氧脅迫關鍵性基因的轉錄調控。有研究顯示細胞在與逆境和活性氧做斗爭的過程中，細胞進化出一套完整的應答調控機制，通過調節(jié)體內活性氧的代謝平衡，來保護DNA、脂質和蛋白質等免受氧化攻擊［23］。胞內相應抗氧化酶表達量提高，抗自由基氧化能力增強。在好氧發(fā)酵過程氧脅迫是影響發(fā)酵菌種生物量和菌體存活的關鍵因素之一。而過表達spt7提高菌體的抗氧化能力，降低氧脅迫對菌體造成的損失，對菌體發(fā)酵及提高發(fā)酵產物產量提供了一個思路。

在15%NaCl的高滲透壓的條件下培養(yǎng)OE spt7轉化子與對照組，生長過程中可見對照組菌體變白，菌落較為干癟且菌體直徑變化不明顯。相對對照組轉化子菌絲依舊為淡黃色，說明菌體在高滲條件下依舊保持較高的活性。從分子層面分析，推測Spt7蛋白對相關Na+/K+-ATPase亞基基因［24］有所調節(jié)，從而提高了菌體對高滲環(huán)境的耐受性。

本研究中的黑曲霉1062最適生長溫度是30℃，但在39℃條件下，OE spt7轉化子較對照組孢子萌發(fā)更快、生長狀態(tài)良好且菌落依然飽滿，但是對照組孢子不僅萌發(fā)緩慢且在后期生長也滯后且菌落干癟、失水嚴重。說明了過表達Spt7可以提高菌體的高溫耐受性。

3.4 OE spt7菌體過氧化物酶轉錄水平分析

常見的抗氧化酶有過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶Orgotein（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），為了驗證該猜測，進一步對這些過氧化物酶做轉錄組分析，驗證過表達Spt7對這些酶的影響。從實驗結果來看，過表達Spt7對CAT的轉錄水平無明顯影響，但是SOD、GPX、CpeB的轉錄水平明顯上調，推測過表達spt7提高了細胞對氧自由基的氧化損傷的防御，因氧化損傷的根本原因是細胞內蛋白結構的破壞，推測Spt7對維持蛋白結構穩(wěn)定性有著決定性的作用。接下來對高溫耐受性的分析及細胞內熱休克打敗的轉錄水平情況分析也進一步證明了該猜測。

在大腸桿菌中有人提出了饑餓誘導交叉保護，即在大腸桿菌細胞生長過程中，因為缺乏必要營養(yǎng)物質而導致細胞生長停滯，細胞內產生過氧化氫酶和其他過氧化物酶使細胞對過氧化氫產生了較強抵抗力［25-28］。另外還有人認為在真核細胞中細胞衰老過程中各種功能逐漸下降是因為在正常生長代謝過程中產生的活性氧（ROS）引起的氧化損傷的累 積［29］。被氧化的蛋白質失去了完整的結構而喪失了催化活性［30］，從而引起細胞的衰老與死亡。在耗氧細胞進化過程中產生了相應的抗氧化機制即抗氧化酶如氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SODs）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPXs）。它們協同工作以保護細胞免受來自內源性代謝或外部微環(huán)境的過多活性氧物種（ROS）的傷害。它們分工明確，其中CAT將H2O2分解為H2O與O2［31］，負責去除高濃度H2O2；而SOD將高活性的超氧陰離子（O2-）歧化為O2與低活性的H2O2［32］；GPXs和PRDXs負責降解低濃度下的H2O2［33］。在實驗中CAT的轉錄水平下調，作者推測是H2O2的濃度對于轉化子來說過低，不足以CAT發(fā)揮作用，所以發(fā)揮主要作用的為SOD以及GPX。

3.5 OE spt7菌體熱休克蛋白轉錄水平分析

以往研究表明，在植物細胞中，高溫會加快細胞內活性氧（ROS）的積累，從而導致細胞衰老甚至死亡［34-36］。同時應激會導致細胞蛋白質平衡失調和細胞內蛋白質聚集［37-38］。熱休克反應機制包括高溫引起的熱休克轉錄因子（heat shock factors HSFs）和熱休克蛋白（heat shock proteins HSPs）的變化［39］。其中HSF是調節(jié)植物中HSP表達的重要轉錄因子。熱休克蛋白具有分子伴侶的功能，可以穩(wěn)定蛋白質，修復受損的蛋白質，并確保在熱應激期間蛋白質的正確組裝和折疊［40］。作者對轉化子及對照組的部分熱激蛋白進行轉錄水平的觀察，有意思的是，在熱激3 h條件下，較對照組相比轉化子的Spt7轉錄水平略微上調，但Hsp40、Hsp70及Hsp90的轉錄水平沒有顯著性差異；在熱激5 h條件下，僅有Hsp90的轉錄水平發(fā)生了差異性的變化。查文獻得知當HSP處于應激狀態(tài)下時，它們的合成速度會很明顯的加快，通常能夠在半小時內達到巔峰水平。因為此狀態(tài)下熱休克蛋白的合成增多，所以其他的蛋白會相應的合成速度降低，合成數量減少［41］。

從菌體表征看過表達Spt7對菌體的生長及對不良環(huán)境的耐受性均有很大的幫助。該蛋白可能對生物細胞內糖代謝、各類氨基酸代謝途徑的關鍵酶基因具有調控作用，作為SAGA復合體的組成成分之一，Spt7可能參與SAGA的調控，在不同的環(huán)境中作為單獨的調控因子對細胞內相關基因進行定向調控。對黑曲霉內Spt7的研究彌補絲狀真菌領域Spt7相關研究的空缺。

4 結論

本文以黑曲霉1062為出發(fā)菌株過表達Spt7，OE spt7轉化子較原始菌株菌絲生長更茂盛，菌絲分枝增多，且分枝變短，菌體產孢延遲但產孢增多。較原始菌株相比OE spt7轉化子的過氧化氫耐受性、高溫耐受性及高滲耐受性均明顯增強。對不同環(huán)境下相關基因的轉錄情況觀察發(fā)現，Spt7通過對抗氧化脅迫及高溫調控關鍵性的基因進行轉錄調控從而提高菌株的不良環(huán)境的抗逆性?？傊?，過表達Spt7有利于菌體的生長及繁殖，在不良環(huán)境下，延長了菌體的時序壽命，增加了菌體對不良環(huán)境的耐受性。