楊亞杰 李昱櫻 申?duì)顮?陳天 榮二花 吳玉香

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)對(duì)于我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)具有重要意義。草棉和亞洲棉是二倍體栽培種，與陸地棉和海島棉相比，草棉和亞洲棉種植面積較少，但草棉具有其它棉種所沒(méi)有的優(yōu)良性狀，如極早熟性、高抗旱性和抗卷曲葉病毒等［1］。同時(shí)A1組的草棉和A2組的亞洲棉是世界上僅有的現(xiàn)存二倍體A染色體組棉種，在棉屬異源四倍體棉種起源及供體種問(wèn)題上，Wendel等［2］和Palmer等［3］認(rèn)為A1是四倍體棉種A基因組的祖先供體種，但多年來(lái)普遍一致的看法是A1組的草棉和A2組的亞洲棉都可能是異源四倍體棉種A基因組的祖先供體種［4］，最新研究表明所有現(xiàn)存的A基因組可能起源于一個(gè)共同的祖先A0，且異源四倍體的形成早于A1和A2的物種形成［5］。

同源多倍體指增加的染色體組來(lái)自同一物種，一般是由二倍體的染色體直接加倍產(chǎn)生的。同一物種經(jīng)過(guò)染色體加倍形成的多倍體，稱(chēng)為同源多倍體。同源多倍體在植物界是比較常見(jiàn)的，如馬鈴薯是一個(gè)天然的同源四倍體［6］，香蕉是天然的同源三倍體［7］。除了自然界天然存在的多倍體以外，人工誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生也成為研究熱點(diǎn)，如水稻［8］、南瓜［9］、油菜［10］等用化學(xué)藥劑處理也獲得了同源四倍體；三倍體西瓜［11］、葡萄［12］、柑橘［13］等都是采用人工的方法獲得的。植物多倍體化具有增大組織器官、增強(qiáng)抗逆性、創(chuàng)造新種質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)［14］。例如，Bhattarai等［15］誘導(dǎo)的四倍體非洲菊比二倍體具有更大的氣孔和更寬、更厚的葉片，且四倍體的花冠變厚，舌狀花變寬，花變大等；尚小紅等［16］對(duì)二倍體及同源四倍體木薯進(jìn)行干旱脅迫，結(jié)果表明四倍體木薯產(chǎn)生較強(qiáng)的抗氧化能力，并通過(guò)赤霉素（GA）、玉米素核苷（ZR）和脫落酸（ABA）的協(xié)同作用，可以延長(zhǎng)四倍體葉片的功能期，從而比二倍體更抗旱；Yin等［17］對(duì)草棉和納爾遜氏棉（G. nelsonii）利用遠(yuǎn)緣雜交和染色體加倍方法獲得了異源四倍體新種質(zhì)（A1A1G3G3），并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和流式細(xì)胞儀鑒定，且新種質(zhì)可以與陸地棉雜交獲得可育后代。

目前關(guān)于草棉同源多倍體的研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)室前期以草棉為材料加倍誘變獲得了同源多倍體草棉，本研究以草棉同源多倍體后代S1為材料，對(duì)其后代進(jìn)行篩選，從流式細(xì)胞儀、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和SRAP分子標(biāo)記來(lái)進(jìn)行鑒定，以期篩選出育性穩(wěn)定且綜合性狀優(yōu)良的草棉多倍體新種質(zhì)用于生產(chǎn)和下一步遺傳研究。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料：二倍體紅星草棉（A1A1，2n=2x=26），以及由實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)過(guò)多倍體誘變所得的草棉同源多倍體后代S1。將材料于2020年5月同時(shí)種植于溫室花盆中進(jìn)行后期觀察和鑒定。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀測(cè)定 將二倍體草棉誘變后收獲的種子（S1）進(jìn)行播種，長(zhǎng)成健康植株后進(jìn)行流式細(xì)胞倍性鑒定，篩選出三倍體和四倍體草棉。分析步驟如下：（1）取0.5 cm2的嫩葉切碎，放于培養(yǎng)皿中，加入400 μL裂解液用于提取完整細(xì)胞核，靜置10 s。（2）用30 μm微孔過(guò)濾膜將其過(guò)濾至樣品管中。（3）向樣品管中加入染液1 600 μL，染色約10 s。（4）上機(jī)測(cè)試（CyFlow Space，Sysmex Partec）。

1.2.2 形態(tài)性狀鑒定 對(duì)經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞倍性鑒定的草棉同源多倍體植株與親本二倍體草棉分別進(jìn)行長(zhǎng)勢(shì)和形態(tài)觀察，包括植株、葉片和花等形態(tài)性狀，并進(jìn)行拍照。在棉花整體進(jìn)入蕾期后，從不同倍性棉花相同節(jié)位處選擇無(wú)病蟲(chóng)害且生長(zhǎng)健康的完全展開(kāi)葉片進(jìn)行觀察和測(cè)量分析，包括形狀、大小、顏色和厚度等性狀。在開(kāi)花期，將草棉三倍體和四倍體完全展開(kāi)的花與二倍體進(jìn)行比較分析，包括苞葉、花萼、花瓣、柱頭、花藥等相關(guān)性狀，比較分析其差異性，從形態(tài)學(xué)角度鑒定不同倍性草棉的差異。

1.2.3 細(xì)胞學(xué)觀察

1.2.3.1 氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和葉綠體數(shù)測(cè)定 取新鮮棉花葉片洗凈，切取主葉脈周?chē)? cm×1 cm大小葉片浸于卡諾氏固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中脫色10 h以上；將脫色后的葉片用蒸餾水清洗幾次，取約2 mm×2 mm大小置于載玻片上，下表皮朝上，滴2滴1%的I2-KI溶液染色2-5 min，之后蓋上蓋玻片；在顯微鏡10×40倍下統(tǒng)計(jì)氣孔密度，取10個(gè)視野作為重復(fù)；在顯微鏡10×100倍的視野下，測(cè)量氣孔長(zhǎng)度和統(tǒng)計(jì)葉綠體數(shù)，取30個(gè)氣孔作為重復(fù)。

1.2.3.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及花粉粒統(tǒng)計(jì) 在不同倍性草棉開(kāi)花期，取新鮮的長(zhǎng)約3-5 mm的花蕾（或當(dāng)天開(kāi)放的花朵），用鑷子剝?nèi)グ~、花萼和花瓣，將4-6?；ㄋ幹糜诟蓛糨d玻片上，滴2滴改良卡寶品紅染液，用解剖針尖部將花藥輕輕壓碎使花粉母細(xì)胞擠出，之后用鑷子去除肉眼可見(jiàn)雜質(zhì)，蓋上蓋玻片，用酒精燈微熱，最后用濾紙覆蓋染色區(qū)域，用拇指在其正上方垂直輕壓蓋玻片以吸去多余染液。在顯微鏡10×40倍下選取600個(gè)花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂行為觀察，并進(jìn)行多分體和花粉粒統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 SRAP分子標(biāo)記鑒定 采用相關(guān)序列多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記進(jìn)行同源多倍體草棉的多態(tài)性鑒定。利用博邁德生物提供的CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒，對(duì)選取的二、三、四倍體草棉新鮮幼嫩葉片提取DNA。SRAP-PCR反應(yīng)體系共10 μL，包含5 μL的2×Taq PCR MasterMix（含染料），2 μL正向和反向引物（10 μmol/L），2 μL去離子水，1 μL模板DNA（50 ng/μL）。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，35℃退火45 s，72℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94℃變性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，之后進(jìn)行銀染和顯影［18］。SRAP引物序列來(lái)自Li等［19］的文獻(xiàn)，由生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 SRAP擴(kuò)增引物Table1 SRAP amplification primers

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制，采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各處理的比較采用最小顯著差（LSD）法（α=0.05），圖表中所用數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

用流式細(xì)胞儀對(duì)9株材料進(jìn)行倍性鑒定，提取葉片細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行分析。表2結(jié)果顯示，二倍體對(duì)照的峰值在189左右，三倍體的峰值在284左右，四倍體的峰值在380左右。在所測(cè)9個(gè)材料中，結(jié)果表明有3株（材料2-4）為四倍體植株，5株（材料5-9）為三倍體植株，材料1為二倍體對(duì)照。

表2 不同倍性材料的熒光峰值Table 2 Fluorescence peaks of different ploidy materials

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.1 植株及葉片形態(tài)比較 由于誘變導(dǎo)致的基因組變化，使不同倍性的植株在形態(tài)上產(chǎn)生了很大的變化（圖1）。二、三和四倍體草棉植株均呈直立生長(zhǎng)，其中二倍體草棉枝葉較多，葉片較小且葉色翠綠；三倍體和四倍體草棉植株明顯矮小，分枝數(shù)量較少，但莖稈較二倍體粗壯，葉片也較二倍體增大，葉色濃綠。結(jié)果表明草棉經(jīng)染色體加倍后，多倍體植株生長(zhǎng)明顯受阻。

圖1 草棉二倍體（A）、三倍體（B）、四倍體（C）植株比較Fig. 1 Comparison of plant among diploid（A），triploid （B）and tetraploid（C）G. herbaceum

經(jīng)觀察不同倍性植株的葉片也產(chǎn)生了很大的變化，由圖2可知，二倍體草棉葉片較小，呈闊葉狀，顏色翠綠，葉裂刻較深，有3-5個(gè)葉裂片；三倍體草棉葉片較大，葉形與二倍體草棉相似，葉色較深；四倍體草棉的葉片明顯大于二倍體草棉，葉色濃綠，葉片厚度也比二倍體草棉厚，且有明顯的皺縮，靠近基部的左右兩個(gè)葉裂沒(méi)有二倍體草棉明顯。

圖2 不同倍性草棉的葉片形態(tài)比較（標(biāo)尺：20 mm）Fig. 2 Leaf morphology comparison among different ploidy G. herbaceum（Ruler：20 mm）

2.2.2 不同倍性草棉花的形態(tài)性狀比較 草棉多倍體花的形態(tài)在不同倍性之間也產(chǎn)生了很大差異，而比較其中的變化也在一定程度上反映了不同倍性棉花之間的聯(lián)系。對(duì)二倍體、三倍體和四倍體草棉的花進(jìn)行比較（圖3-圖5），分析其形態(tài)性狀表明：二倍體草棉的花冠呈黃色，花朵和苞葉均較小，花瓣邊緣呈鋸齒狀，5片花瓣中有1片明顯較小，花瓣基部有深紅色花斑，花藥橘黃色、較小、全部散粉（圖3-A，圖4，圖5左）。三倍體草棉的花冠呈白色，花朵較大，苞葉窄長(zhǎng)，花瓣邊緣不規(guī)則，花斑較小甚至沒(méi)有，淡紫色花斑，花藥淡黃色、多為干癟、僅少量散粉（圖3-B，圖5右）。四倍體草棉的花冠為黃色、較二倍體深，花朵和苞葉均較二倍體寬大，花瓣邊緣規(guī)則、平整，有紫紅色花斑，花藥黃色、較大、部分散粉（圖3-C，圖4，圖5左）。

圖3 草棉二倍體（A）、三倍體（B）、四倍體（C）花的形態(tài)比較Fig. 3 Comparison of flower morphology among diploid（A），triploid（B）and tetraploid（C）G. herbaceum

圖4 二倍體和四倍體草棉的花朵及雌雄蕊比較（標(biāo)尺：20 mm）Fig. 4 Flowers，pistil and stamens comparison between diploid and tetraploid G. herbaceum（Ruler：20 mm）

圖5 不同倍性草棉的花的分解圖（標(biāo)尺：20 mm）Fig. 5 Decomposition map of flowers among different ploidy G. herbaceum（Ruler：20 mm）

2.3 細(xì)胞學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 葉片氣孔性狀觀察和鑒定 葉片的氣孔性狀是指氣孔的大小、氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)中的葉綠體數(shù)，是判斷植物倍性的重要細(xì)胞學(xué)指標(biāo)。對(duì)不同倍性草棉的葉片氣孔性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖6），由表3結(jié)果得知，二、三和四倍體草棉在氣孔密度、氣孔長(zhǎng)度和葉綠體數(shù)上都存在著顯著差異（P＜0.05）；隨著倍性的增加，氣孔密度呈下降趨勢(shì)，而氣孔長(zhǎng)度和葉綠體數(shù)均呈上升趨勢(shì)。本研究結(jié)果和前人研究結(jié)果一致［20］。

圖6 不同倍性草棉的葉片氣孔比較（標(biāo)尺：20 μm）Fig. 6 Leaf stomatal comparison among different ploidy G. herbaceum（Ruler：20 μm）

表3 不同倍性草棉的葉片氣孔性狀統(tǒng)計(jì)Table 3 Stomatal character statistics of leaves among different ploidy G. herbaceum

2.3.2 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察和測(cè)定 為了進(jìn)一步研究不同倍性草棉的細(xì)胞遺傳學(xué)特性，本試驗(yàn)對(duì)二、三和四倍體草棉的減數(shù)分裂行為分別進(jìn)行觀察，三者的減數(shù)分裂行為均有正常和異常兩種表現(xiàn)（圖7）。由表4得知：在二倍體草棉的600個(gè)多分體中，分別有1個(gè)單分體（0.17%），2個(gè)二分體（0.33%），25個(gè)三分體（4.17%），569個(gè)正常四分體（94.83%），1個(gè)異常四分體（0.17%）和2個(gè)其他多分體（0.33%）。在三倍體草棉的600個(gè)多分體中，分別有15個(gè)單分體（2.50%），4個(gè)二分體（0.67%），60個(gè)三分體（10.00%），324個(gè)正常四分體（54.00%），5個(gè)異常四分體（0.83%）和195個(gè)其他多分體（32.50%）。在四倍體草棉的600個(gè)多分體中，分別有13個(gè)單分體（2.17%），14個(gè)三分體（2.33%），442個(gè)正常四分體（73.67%），5個(gè)異常四分體（0.83%）和126個(gè)其他多分體（21.00%）。觀察得知，三倍體的四分體染色不均勻，四倍體較二倍體染色淺，說(shuō)明四倍體的育性正在恢復(fù)，還有待于進(jìn)一步穩(wěn)定。

表4 不同倍性草棉減數(shù)第二次分裂末期的多分體數(shù)量及比例Table 4 Number of multispores in telophase II of different ploidy G. herbaceum

圖7 不同倍性草棉的正常和異常減數(shù)分裂行為（標(biāo)尺：20 μm）Fig. 7 Normal and abnormal meiosis behavior of different ploidy G. herbaceum（Ruler：20 μm）

2.3.3 不同倍性草棉花粉粒統(tǒng)計(jì)結(jié)果 由于染色體數(shù)目的加倍，使不同倍性草棉的花粉粒也產(chǎn)生了很大的變化，對(duì)花粉粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)可以反映不同倍性草棉大致的育性情況（圖8）。由表5看出，二、三和四倍體草棉的花粉粒直徑存在顯著差異，隨著倍性的增加，花粉粒直徑呈上升趨勢(shì)。此外，在二倍體草棉的600個(gè)花粉粒中，有572個(gè)正?；ǚ哿＃ㄕ?5.33%），28個(gè)為異?；ǚ哿＃ㄕ?.67%）；三倍體的600個(gè)花粉粒中，有353個(gè)正?；ǚ哿＃ㄕ?8.83%），247個(gè)為異?；ǚ哿＃ㄕ?1.17%）；四倍體的600個(gè)花粉粒中，有466個(gè)正?；ǚ哿＃ㄕ?7.67%），134個(gè)為異?；ǚ哿＃ㄕ?2.33%）。

表5 不同倍性草棉的花粉粒統(tǒng)計(jì)Table 5 Pollen grains statistics among different ploidy G. herbaceum

圖8 不同倍性草棉的正常和異?；ǚ哿＃?biāo)尺：20 μm）Fig. 8 Normal and abnormal pollen grains of different ploidy G. herbaceum（Ruler：20 μm）

2.4 SRAP分子鑒定結(jié)果

對(duì)5對(duì)正向引物和5對(duì)反向引物組成的25對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，最終選用14對(duì)引物對(duì)二、三和四倍體草棉進(jìn)行DNA水平上的分析。對(duì)14組條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表6），與2X相比，3X共有297條清晰條帶，其中有240條與2X相同，20條缺失，37條新增條帶，遺傳比例分別為80.81%、6.73%和12.46%；4X共有299條清晰條帶，其中有229條與2X相同，32條缺失，39條新增條帶，遺傳比例分別為76.59%、10.37%和13.04%。

表6 不同倍性草棉的SRAP多態(tài)性來(lái)源Table 6 Resources of SRAP polymorphism among different ploidy G. herbaceum

此外，14組引物條帶擴(kuò)增出的分子量范圍均在50-500 bp之間。在這14組引物條帶中，3X在引物組合Me 2/Em 1、Me 2/Em 3、Me 3/Em 1、Me 3/Em 3、Me 4/Em 3中除了擴(kuò)增出與2X完全一致的條帶外還出現(xiàn)了新的條帶；在引物Me 2/Em 5、Me 4/Em 2中僅出現(xiàn)了條帶的缺失；其余7組引物中既有條帶的缺失也有新增的條帶。4X在引物組合Me 4/Em 1中僅擴(kuò)增出與2X完全一致的條帶（圖9-B）；在引物Me 3/Em 1、Me 3/Em 3中除了相同的條帶還出現(xiàn)特異條帶；在引物Me 1/Em 5、Me 2/Em 4、Me 2/Em 5、Me 3/Em 2中僅出現(xiàn)條帶的缺失；剩余引物中既有條帶的缺失也有特異條帶。以上結(jié)果得知，3X和4X不僅擴(kuò)增出與2X完全一致的條帶，還出現(xiàn)了條帶的缺失與新的特異性條帶，且隨著倍性的增加，相同條帶變得更寬更亮（圖9），表明染色體加倍之后基因產(chǎn)生了劑量效應(yīng)，以及在加倍過(guò)程中可能出現(xiàn)了染色體重排，從分子水平上進(jìn)一步證明同源多倍體草棉的真實(shí)性。

圖9 SRAP引物在不同倍性草棉中的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 9 Amplification results of SRAP primers among different ploidy G. herbaceum

3 討論

3.1 多倍化導(dǎo)致新表型性狀的產(chǎn)生及原因

表型變異是自然選擇的重要依據(jù)，因此，多倍化導(dǎo)致表型創(chuàng)新是關(guān)于多倍化能否促進(jìn)物種多樣化爭(zhēng)論的焦點(diǎn)［21］。新形成的多倍體顯著特征是基因組不穩(wěn)定，進(jìn)而進(jìn)行快速重構(gòu)，使多個(gè)基因組在細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定共存［22-23］，所以二倍體親本在經(jīng)歷多倍化后，本身已進(jìn)化完美的減數(shù)分裂行為會(huì)被擾亂，在新形成的多倍體中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非整倍體、染色體重排與其他類(lèi)型基因結(jié)構(gòu)變異［24-26］。本研究中，染色體加倍獲得的草棉同源多倍體S1播種鑒定表明不僅有四倍體植株，也有三倍體植株，并且不同倍性的草棉植株在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方面的差異明顯。除基因組結(jié)構(gòu)改變外，多倍體植株也會(huì)發(fā)生基因表達(dá)的變化，例如，Xu等［27］對(duì)兩個(gè)亞種粳稻和秈稻及其F1雜種與四倍體后代進(jìn)行表型性狀與基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，約有42%和50%的同源基因在雜種和多倍體中出現(xiàn)明顯的基因表達(dá)差異，并導(dǎo)致不同雜種與多倍體后代個(gè)體間產(chǎn)生了明顯的表型性狀分化。在本研究中，觀察到不同倍性草棉植株個(gè)體間表型性狀差異明顯，包括植株、葉片、氣孔、花、花粉粒等性狀，因此推斷二倍體草棉經(jīng)過(guò)染色體加倍后，其多倍體后代基因組間需要重新進(jìn)行功能分配，進(jìn)而產(chǎn)生新的表型性狀及差異。

3.2 多倍體鑒定方法探討

通過(guò)形態(tài)觀察可以初步篩選出變異植株，也是簡(jiǎn)單快速的方法。當(dāng)誘變材料較多時(shí)，采用形態(tài)學(xué)進(jìn)行初步鑒定，能大大減少工作量。器官巨大化是多倍體植株重要的指標(biāo)之一，在許多研究報(bào)道中早已被證實(shí)［13，28］。在本試驗(yàn)中草棉多倍體植株的葉片比二倍體寬厚，有明顯皺縮，顏色較深，花器官明顯增大，生長(zhǎng)緩慢。經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞倍性鑒定后，前期通過(guò)形態(tài)觀察初步篩選的植株全部為多倍體。通過(guò)解剖葉片結(jié)構(gòu)，觀察測(cè)量氣孔大小、氣孔密度和保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)中的葉綠體數(shù)也可以間接鑒定植株倍性，隨著倍性的增加，氣孔密度降低，氣孔大小和葉綠體數(shù)目增大。Chen等［29］采用秋水仙堿處理蘆筍獲得了四倍體誘變植株，發(fā)現(xiàn)四倍體蘆筍的氣孔密度約為二倍體的一半，而葉綠體數(shù)量是二倍體的兩倍，以及氣孔長(zhǎng)度和寬度略大于二倍體植株。所以氣孔密度、保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)度和葉綠體數(shù)目也是鑒定植株倍性的重要依據(jù)，該方法易取材，損傷小，操作簡(jiǎn)單，但當(dāng)鑒定群體中存在嵌合體和非整倍體植株時(shí)就難以區(qū)分。本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)不同倍性的草棉葉片進(jìn)行解剖學(xué)觀察，其各自的氣孔密度、氣孔長(zhǎng)度和保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)中的葉綠體數(shù)目均符合上述規(guī)律。此外，花粉粒直徑的大小也與此相似，多倍體的花粉粒直徑比二倍體的顯著增大。

花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程是否正常，是花粉可育的關(guān)鍵。研究表明多倍體減數(shù)分裂的異常行為要明顯多于原始二倍體［30-31］。同時(shí)，植株在經(jīng)歷多倍化后，新形成的多倍體物種中不同的染色體組間需要重新進(jìn)行功能分配，這常常導(dǎo)致其在進(jìn)化初期階段的育性迅速降低［32］。本研究中，二倍體、三倍體和四倍體草棉的正常四分體占比分別為94.83%、54.00%和73.67%，正?；ǚ哿Ｕ急确謩e為95.33%、58.83%和77.67%。同源四倍體草棉正?；ǚ哿１壤^二倍體低，這可能是存在較多的異常多分體，進(jìn)而導(dǎo)致異?；ǚ哿５漠a(chǎn)生；也可能是正常四分體也會(huì)發(fā)生染色體減少或丟失［33］；還可能是正常配子形成的成熟花粉粒受到外界不良環(huán)境的影響。此外，我們對(duì)不同倍性草棉進(jìn)行花粉粒統(tǒng)計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)花粉粒的成熟時(shí)期具有不同步性，同一花蕾的不同花藥之間會(huì)存在花粉粒和四分體同時(shí)出現(xiàn)。因此同源四倍體草棉的育性仍需進(jìn)一步恢復(fù)和穩(wěn)定。

對(duì)于同源多倍體植株也可以進(jìn)行分子鑒定。彭瀅等［34］對(duì)16株四倍體枳橙植株進(jìn)行SSR鑒定，其擴(kuò)增帶型與二倍體完全相同。SRAP分子標(biāo)記鑒定是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，本研究利用SRAP分子標(biāo)記方法，多倍體擴(kuò)增出與二倍體完全一致的條帶，且條帶變得更寬更亮，證實(shí)了同源多倍體草棉的真實(shí)性。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，同源四倍體的多態(tài)性比例（23.41%）比三倍體（19.19%）高，這可能是二倍體草棉通過(guò)秋水仙堿誘導(dǎo)成同源四倍體過(guò)程中，引起了堿基序列改變，形成可與引物雜交的新位點(diǎn)，或是同源四倍體的等位基因發(fā)生了漂移，從而表現(xiàn)出基因組DNA多態(tài)性［35］。三倍體是草棉同源多倍體后代S1通過(guò)流式細(xì)胞篩選獲得的，其染色體組介于二倍體和四倍體之間，因此具有的DNA特異性片段比例沒(méi)有四倍體高。研究還發(fā)現(xiàn)除不同倍性草棉之間存在較大遺傳差異外，四倍體和三倍體內(nèi)部植株之間也表現(xiàn)出差異。

從Delaat［36］首次采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)植物倍性水平以來(lái)，該方法受到研究者的青睞，廣泛應(yīng)用于各種植物倍性鑒定中［29，37］。較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定和細(xì)胞學(xué)鑒定相比，其檢測(cè)通量高，精準(zhǔn)度高。本試驗(yàn)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果得出，在草棉同源多倍體后代S1中，有3株四倍體和5株三倍體，但該結(jié)果還需結(jié)合染色體壓片技術(shù)對(duì)植株倍性進(jìn)行更準(zhǔn)確的鑒定。

以上鑒定方法可以直接或間接證實(shí)多倍體植株的真實(shí)性，此外，人工誘變的多倍體植株能否成功結(jié)鈴是判斷多倍體育性恢復(fù)及穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)之一。本試驗(yàn)于2021年1月溫室收獲了3株草棉同源四倍體S2種子，而5株同源三倍體草棉均不能結(jié)鈴。本研究所用材料冬天都保存于溫室，同源四倍體草棉植株能平安在溫室越冬，而二倍體草棉不能越冬全部死亡，進(jìn)一步說(shuō)明了四倍體植株抗寒性明顯優(yōu)于二倍體植株。所以我們期望篩選出育性穩(wěn)定且綜合性狀優(yōu)良的草棉同源四倍體新種質(zhì)用于生產(chǎn)和下一步遺傳研究。而三倍體草棉可以作為棉花育種的橋梁材料，比如加倍成六倍體草棉，或者再與其它栽培棉雜交獲得新的種質(zhì)材料。

4 結(jié)論

在同源多倍體草棉后代S1中鑒定出3株四倍體和5株三倍體；形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)多倍體表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)；SRAP分子鑒定證實(shí)了同源多倍體草棉的真實(shí)性，以及在加倍過(guò)程中發(fā)生了染色體重排。同時(shí)，獲得同源四倍體草棉S2種子。