焦陽

上海上藥中西制藥有限公司（上海 201806）

硫酸羥氯喹，即（±）-2-[[4-[（7-氯-4-喹啉基）氨基]苯基]-乙氨基]乙醇硫酸鹽，其化學(xué)式為C18H26ClN3O·H2SO4，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 硫酸羥氯喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種常見的免疫和炎癥性疾病，臨床病癥主要為骨節(jié)組織受損，常呈現(xiàn)肢體腫脹、骨節(jié)作痛且硬實強直等情況[1]。糖尿病是一種代謝性疾病，主要臨床特征表現(xiàn)為慢性血糖增高。糖尿病病人的胰島β細(xì)胞只能分泌正常人體胰島素含量的一半左右，嚴(yán)重妨礙了人體控制血糖能力[2]，影響身體健康。

硫酸羥氯喹是醫(yī)治類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎合并糖尿病病人的常用抗瘧藥，且安全性高。該藥物除可以緩解病人的關(guān)節(jié)炎病癥，還能阻礙血小板的聚集，起到降血糖、抗血脂的作用。20世紀(jì)50年代，隨著抗瘧藥應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的診治，部分病人在接受抗瘧藥物醫(yī)治后出現(xiàn)了低血糖征象，硫酸羥氯喹醫(yī)治風(fēng)濕性疾病療效顯著[3-4]。硫酸羥氯喹因為具有獨特的作用機制，且安全性較好，所以在臨床風(fēng)濕病領(lǐng)域被普遍應(yīng)用，至20世紀(jì)90年代，硫酸羥氯喹用于醫(yī)治90%以上的臨床風(fēng)濕病[5]。

環(huán)氧乙烷是硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質(zhì)，過量吸入會引起急性中毒，損害呼吸系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)；如果周圍環(huán)境含大量環(huán)氧乙烷，會對眼睛和上呼吸道產(chǎn)生刺激，并伴有嚴(yán)重的頭痛、惡心和嘔吐，嚴(yán)重者呼吸困難，昏迷，甚至死亡。環(huán)氧乙烷還是人體致癌致畸物質(zhì)，若孕婦接觸，流產(chǎn)率會增高[6-7]。因此，為保證患者安全用藥，需對藥品中環(huán)氧乙烷的量進行控制。

依據(jù)人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會ICH M7（R1）《評估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變性）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險》指南，環(huán)氧乙烷的可接受攝入量按21.3μg/d進行控制，結(jié)合硫酸羥氯喹原料每日最大攝入量（400 mg），所含環(huán)氧乙烷的限度為0.005 325%，即嚴(yán)格控制硫酸羥氯喹中環(huán)氧乙烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得超過0.005 325%。采用頂空-氣相色譜法對硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質(zhì)環(huán)氧乙烷的殘留量進行研究，參考ICH Q2（R′）《分析方法驗證：正文和方法學(xué)》雜質(zhì)定量檢測方法學(xué)驗證要求，系統(tǒng)進行了驗證。

1 實驗部分

1.1 儀器

MS105電子分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent 7697A頂空進樣器，安捷倫科技有限公司；GC2014C氣相色譜儀、DANI HSS 86.50 Plus頂空進樣器，島津制作所。

1.2 試劑

環(huán)氧乙烷（批號KYEK402），北京伊諾凱科技有限公司；乙腈（批號R141827），北京迪科馬科技有限公司；乙腈（批號JB09130），默克股份兩合公司。環(huán)氧乙烷為分析純，乙腈為色譜純。

1.3 樣品

硫酸羥氯喹樣品（批號HS20181101V，HS20181102V，HS20181103V），上海中西三維藥業(yè)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×1.80μm）。升溫程序：起始溫度為35℃，保持3 min，以25℃/min的速率升溫至150℃，保持3 min。進樣口溫度為120℃，氫火焰離子化檢測器（FID）溫度為200℃，頂空平衡溫度為60℃，進樣環(huán)溫度為75℃，傳輸線溫度為100℃；頂空平衡時間為15 min；柱流量為2.0 mL/min；進樣量為1 mL，分流比為10∶1；載氣為氮氣；氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為400 mL/min，氮氣流速為25 mL/min。

1.4.2 溶液的配制

（1）稀釋劑：乙腈。

（2）對照品溶液：取適量環(huán)氧乙烷（低溫下）精密稱定，用乙腈稀釋，配制成1 mL中約含環(huán)氧乙烷10.65μg的溶液。

（3）供試品溶液：精密稱定環(huán)氧乙烷200 mg，置于頂空瓶中，加乙腈1 mL，密封，搖勻。

1.4.3 測定方法精密量取稀釋劑乙腈、對照品及供試品溶液各1 mL，置于頂空瓶中，密封，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖；采用外標(biāo)法，以峰面積計算各溶液中環(huán)氧乙烷的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性試驗

取適量環(huán)氧乙烷粉末（約200 mg），精密稱定，置于頂空瓶中，精密加入對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為加標(biāo)溶液；分別取稀釋劑乙腈及對照品溶液、加標(biāo)溶液、供試品溶液，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。環(huán)氧乙烷的拖尾因子為1.1，峰保留時間為2.384 min，理論塔板數(shù)為10 390.3。結(jié)果表明：稀釋劑乙腈與供試品溶液中的雜質(zhì)峰對檢測均無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.2 檢測限、定量限測定

取環(huán)氧乙烷對照品適量（低溫條件下），精密稱定，加乙腈定量稀釋成一系列質(zhì)量濃度的溶液，分別頂空進樣分析，記錄色譜圖。檢測限按信噪比3∶1計算，定量限按信噪比10∶1計算。定量限溶液平行配制6份，分別頂空進樣分析，計算峰面積和保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果見表1～2。

表1 環(huán)氧乙烷檢測限、定量限測定結(jié)果

表2 環(huán)氧乙烷定量限試驗結(jié)果

環(huán)氧乙烷檢測限、定量限均遠(yuǎn)低于限度。定量限質(zhì)量濃度下6份樣品的峰面積RSD為3.4%，小于10.0%，保留時間的RSD為0.1%，小于2.0%，表明方法靈敏度良好。

2.3 線性和范圍試驗

取環(huán)氧乙烷對照品適量（低溫條件下），精密稱定，加乙腈稀釋成每1 mL中約含環(huán)氧乙烷106.5μg的溶液，得線性儲備液（10倍對照品質(zhì)量濃度）。分別移取儲備液，1 mL置于20 mL容量瓶中、2 mL置于25 mL容量瓶中、1 mL置于10 mL容量瓶中、3 mL置于25 mL容量瓶中、3 mL置于20 mL容量瓶中、2 mL置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋、定容至刻度，作為線性供試液；另取定量限溶液作為線性供試液。

精密量取上述7個線性供試液各1 mL，分別置于頂空瓶中，進樣分析，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸。結(jié)果見圖2。

圖2 環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線

環(huán)氧乙烷線性方程為y=4.365 0x-1.285 9（r=0.999 5）。環(huán)氧乙烷在定量限至2倍限度范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好；相關(guān)系數(shù)r=0.999 5，大于0.999；Y軸截距為2.84%，在100%響應(yīng)值的10.0%以內(nèi)；響應(yīng)值（A/C）RSD為2.18%，小于10.0%。

2.4 精密度試驗

2.4.1 進樣精密度

精密量取同一對照品溶液6份，每份1 mL，置于6個頂空瓶中，密封，連續(xù)進樣，記錄色譜圖。

對照品溶液連續(xù)進樣6次，環(huán)氧乙烷峰面積RSD為3.5%，小于5.0%，表明進樣精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性

精密稱定環(huán)氧乙烷約200 mg，置于頂空瓶中，加對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為重復(fù)性溶液，平行配制6份。

取對照品溶液、重復(fù)性溶液，分別頂空進樣，計算6份供試液中環(huán)氧乙烷殘留量的RSD，記錄色譜圖，結(jié)果見表3。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果%

6份重復(fù)性溶液中環(huán)氧乙烷殘留量的RSD為2.3%，小于5.0%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3 中間精密度照2.4.2方式配制樣品，由不同的分析員在不同日期使用不同的儀器進行檢驗，結(jié)果見表4。

表4 中間精密度試驗結(jié)果

由表4計算可知，不同人員在不同日期配制的12份加標(biāo)供試品溶液中環(huán)氧乙烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為3.3%，小于10.0%，表明精密度良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗

精密稱定環(huán)氧乙烷約200 mg，置于頂空瓶中，加對照品溶液1 mL，密封，搖勻，作為穩(wěn)定性溶液，平行配制5份。

取穩(wěn)定性溶液，在室溫下放置，分別在0，2，4，6，8 h進樣分析，計算峰面積的RSD，考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在8 h內(nèi)，樣品中環(huán)氧乙烷峰面積的RSD小于5.0%，說明溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 準(zhǔn)確度試驗

對照品貯備液配制：稱取環(huán)氧乙烷適量（低溫條件下），加乙腈稀釋成每1 mL中約含環(huán)氧乙烷106.5 μg的溶液，作為對照品貯備液（10倍對照質(zhì)量濃度），平行配制3份。

50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液的配制：分別取對照品貯備液2.5 mL置于50 mL容量瓶中、5 mL置于50 mL容量瓶中、3 mL置于20 mL容量瓶中，用乙腈定容，分別平行配制3份。

平行配制2份供試品溶液。

取100%對照品溶液，精密量取1 mL，置于頂空瓶中，密封，平行3份。

準(zhǔn)確度溶液配制：取環(huán)氧乙烷約200 mg，精密稱定，置于頂空瓶中，配制9份（分3組），每組分別精密加入50%對照品溶液、100%對照品溶液、150%對照品溶液各1 mL，搖勻即得。

取稀釋劑乙腈、供試品溶液、100%對照品溶液和準(zhǔn)確度溶液，分別頂空進樣，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖并計算其回收率，結(jié)果見表5。

表5 環(huán)氧乙烷準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

在50%～150%質(zhì)量濃度水平下，環(huán)氧乙烷回收率在98.47%～105.75%之間，平均回收率為102.08%，RSD為2.7%?；厥章示?0.0%～110.0%之間，RSD小于5.0%，表明方法準(zhǔn)確度好。

2.7 耐用性試驗

加標(biāo)供試品溶液配制同2.1。

分別取稀釋劑乙腈、對照品溶液、加標(biāo)供試品溶液，在標(biāo)準(zhǔn)色譜條件、色譜柱流量變化±0.2 mL/min、起始溫度變化±2℃、頂空平衡時間變化±5 min時頂空進樣分析，計算環(huán)氧乙烷殘留量的RSD，考察耐用性，結(jié)果見表6。

由表6可知，在色譜柱流量變化±0.2 mL/min、柱溫起始溫度變化±2℃、頂空平衡時間變化±5 min時，乙腈、樣品溶液中的雜質(zhì)峰對檢測均無干擾，環(huán)氧乙烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD均小于10.0%，表明方法耐用性良好。

表6 耐用性試驗結(jié)果

2.8 樣品檢測

用確定的色譜條件進行樣品檢測，結(jié)果見表7。

表7 樣品測定結(jié)果

3批樣品中環(huán)氧乙烷均未檢出，說明樣品質(zhì)量符合要求。

3 結(jié)語

采用DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm×1.80 μm），以氮氣為載氣、氫氣為燃料氣、空氣為輔助燃?xì)?，持續(xù)升溫，建立了頂空-氣相色譜法對硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質(zhì)環(huán)氧乙烷的檢驗分析方法。該方法專屬性高，稀釋劑（乙腈）及供試品中的雜質(zhì)峰對檢測均無干擾，精密度好、耐用性優(yōu)異，溶液質(zhì)量濃度和峰面積之間的相關(guān)性顯著。總之，該方法操作簡便，檢測快速，結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，適用于硫酸羥氯喹潛在基因毒性雜質(zhì)環(huán)氧乙烷的檢測。