任瑩 連通 張春義 姜凌

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

在蛋白質(zhì)合成過程中，甲硫氨酸起著非常重要的作用，它不僅是蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)，而且是甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的前體［1］。葉酸是一種非常重要的水溶性B族維生素，作為一碳單位的供體參與很多代謝反應(yīng)［2］。甲硫氨酸合酶是產(chǎn)生甲硫氨酸和四氫葉酸的關(guān)鍵酶，以5-甲基四氫葉酸和同型半胱氨酸作為底物，通過甲硫氨酸代謝途徑生成甲硫氨酸和葉酸［3］。人體長期缺乏甲硫氨酸和葉酸會(huì)增加脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤發(fā)生的概率，甚至?xí)?dǎo)致結(jié)直腸癌和乳腺癌的發(fā)生［4］。甲硫氨酸和葉酸主要從植物性膳食中攝取，但它們?cè)谧魑锓N子中含量相對(duì)不高，特別是甲硫氨酸在豆類植物（如大豆和豌豆等）種子中的比例尤其不足［5］。以植物為主的膳食，其甲硫氨酸的含量只有平衡膳食所需量的50%-75%［6］，葉酸的攝入量也只有世界衛(wèi)生組織推薦攝入量的45%-75%［7］。

玉米（Zea mays L.）是我國主要經(jīng)濟(jì)糧食作物之一，是我國種植面積最大的糧食作物［8］。因此，了解玉米甲硫氨酸的積累及其如何影響種子的萌發(fā)對(duì)提高玉米籽粒品質(zhì)和種子萌發(fā)率具有重要意義。

甲硫氨酸作為葉酸代謝與含硫氨基酸代謝的連接點(diǎn)，如何提高作物中的含量也被廣泛研究［9-17］。目前，研究者提高作物中甲硫氨酸含量并改善種子的營養(yǎng)品質(zhì)主要是通過過表達(dá)種子特異、富含甲硫氨酸的貯藏蛋白，減少缺乏甲硫氨酸的貯藏蛋白，沉默甲硫氨酸分解酶，或者上調(diào)參與甲硫氨酸合成的關(guān)鍵生物合成酶［9-13］。如，在馬鈴薯和擬南芥中通過RNA干擾降低了蘇氨酸合成酶（threonine synthetase，TS）轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致甲硫氨酸水平顯著增加30倍和47倍［10-14］；在亞麻中過表達(dá)O-乙酰絲氨酸裂解酶（O-acetylserine（thiol）-lyase，OASTL），甲硫氨酸含量增加3-8倍［15］；在擬南芥中過表達(dá)甲硫氨酸-S-腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine-sadenosyltransferase，MMT）和同型半胱氨酸-S-腺苷轉(zhuǎn) 移 酶（homocysteine-s-adenosyltransferase，HMT）都可以檢測(cè)到甲硫氨酸含量的增加［16］；過表達(dá)擬南芥胱硫醚 γ-合酶（cystathionine γ-synthase，CGS）的馬鈴薯塊莖中的甲硫氨酸含量是野生型塊莖的2倍［17］；在水稻中組成型過表達(dá)大腸桿菌絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（serine acetyltransferase，SAT）導(dǎo)致游離蛋氨酸增加40%，而蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸顯著增加了近5倍［18］；在大豆中引入富硫蛋白質(zhì)的合成基因，種子中甲硫氨酸和半胱氨酸分別顯著增加16%和66%［19］。不過在馬鈴薯中過表達(dá)編碼甲硫氨酸合酶的基因，甲硫氨酸水平?jīng)]有發(fā)生顯著變化［20］。

近年來，對(duì)于甲硫氨酸合酶的研究主要來自模式生物擬南芥和煙草。擬南芥的甲硫氨酸合酶被認(rèn)為同時(shí)存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中，分別參與甲硫氨酸的從頭合成與甲基代謝［21］。在煙草花中，甲硫氨酸合酶的轉(zhuǎn)錄物積累模式與甲基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄物積累模式完全匹配［22］。其他研究表明，甲硫氨酸對(duì)擬南芥種子的萌發(fā)也非常重要。參與甲硫氨酸代謝的酶豐度在萌發(fā)期間迅速增加［23］。甲硫氨酸也可能通過腺苷甲硫氨酸促進(jìn)乙烯和多胺的合成，進(jìn)一步促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長［24］，同時(shí)可以激活擬南芥谷氨酸受體同源物AtGLR 3.5 Ca2+通道，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，抑制ABA不敏感轉(zhuǎn)錄因子（ABSCISIC ACID INSENSITIVE 4）表達(dá)，降低種子對(duì)ABA的敏感性，促進(jìn)種子萌發(fā)，最終使種子萌發(fā)率升高［25］。

目前，關(guān)于作物甲硫氨酸合酶基因的功能研究鮮見報(bào)道，急需開展作物中甲硫氨酸和葉酸的積累機(jī)制的研究。本研究擬克隆玉米甲硫氨酸合酶編碼的3個(gè)同源基因METS1、METS2和METS3，在組織表達(dá)特性和萌發(fā)過程中，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)其進(jìn)行分析，為深入研究甲硫氨酸合酶在玉米籽粒甲硫氨酸和葉酸積累過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料為玉米自交系B73，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存，2021年4月種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所試驗(yàn)田（河北省廊坊萬莊）。取B73的根、莖、葉、雄穗、幼嫩雌穗和授粉后25 d的籽粒、胚及胚乳，用液氮迅速冷凍，-80℃保存。取B73玉米干種子于25℃純凈水中進(jìn)行萌發(fā)，取萌發(fā)時(shí)間為0、12、24、36、48、60和72 h的籽粒于液氮中速凍，-80℃保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 總RNA提取試劑盒購自百奧曼科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技公司；高保真DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、pEASY?-Blunt Cloning Kit、實(shí)時(shí)熒光定量TransStart Top Green qPCR SuperMix購自全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)T1購自全式金生物技術(shù)有限公司。引物（表1）合成及測(cè)序由華大基因完成。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 ZmMETS的克隆 提取B73葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板擴(kuò)增ZmMETS。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，與克隆載體pEASY?-Blunt連接，提取陽性克隆質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證序列是否為目的序列。

1.2.2 ZmMETS的生物信息學(xué)分析 利用ProtScale程序（https://expasy.org/cgibin/protscale.pl）分析蛋白質(zhì)疏水性；利用ProtParam分析蛋白的理化性質(zhì)；使用SMART（https://smart.embl-heidelberg.de）預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域；利用SWISS-MODEL（https://SWISSMODEL.expasy.org）預(yù)測(cè) ZmMETS1/ZmMETS2/ ZmMETS3的三維結(jié)構(gòu)；用MEGA7.0軟件中的最大似然法（Maximum likelyhood method）構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 ZmMETS的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)分析 使用全式金試劑盒TransStart Top Green qPCR SuperMix，根據(jù)說明書進(jìn)行體系的配制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序?yàn)?4℃ 30 s；94℃ 5 s，58℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；根據(jù)賽默飛世爾科技QuantStudio1儀器設(shè)定溶解曲線程序。通過2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。以玉米甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）編碼基因ZmGAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 ZmMETS的蛋白信息分析

提取B73葉片的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，運(yùn)用RT-PCR方法分別獲得包括開放閱讀框的3個(gè)片段，長度分別為2 352、2 822和2 758 bp。挑取陽性克隆測(cè)序后得到ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3開放閱讀框的核苷酸序列。經(jīng)過分析，ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3核苷酸編碼序列長度分別為2 301、2 298和 2 298 bp。

通過軟件預(yù)測(cè)明確3個(gè)蛋白的分子量均為84.5 kD，均為親水性蛋白質(zhì)（圖1-A-C）。ZmMETS1、ZmMETS2、ZmMETS3的等電點(diǎn)分別為5.54、5.83和5.85。這3個(gè)蛋白都含有2個(gè)非依賴鈷胺素合酶結(jié)構(gòu)域（圖1-D-F），分別位于N端和C端。

圖1 ZmMETS的親疏水性和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of hydrophilicity，hydrophobicity，and protein domain of ZmMETS

3個(gè)ZmMETS蛋白結(jié)構(gòu)高度相似，都含有分別負(fù)責(zé)結(jié)合和催化的2個(gè)結(jié)構(gòu)域。利用Swiss-model在線網(wǎng)站對(duì)ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示3個(gè)蛋白得到的預(yù)測(cè)模型一樣，含有2個(gè)結(jié)構(gòu)域，合酶1結(jié)構(gòu)域位于N端，執(zhí)行結(jié)合功能，合酶2結(jié)構(gòu)域位于C端，執(zhí)行催化功能，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由α螺旋環(huán)繞平行的β片層構(gòu)成的立體結(jié)構(gòu)，甲硫氨酸位于C端結(jié)構(gòu)域（圖2）。將代表性物種中的METS同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，玉米中的METS和高粱的同源蛋白親緣關(guān)系最近（圖3）。

圖2 ZmMETS的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，甲硫氨酸位于C端結(jié)構(gòu)域Fig.2 Three-dimensional structure prediction of ZmMETS，and methionine locates in C-terminal domain

圖3 METS同源基因的進(jìn)化分析Fig.3 Evolutionary analysis of METS homologous proteins

2.2 ZmMETS的組織表達(dá)模式分析

通過提取散粉時(shí)期玉米的根、莖、葉、雄穗、雌穗以及授粉后25 d的胚、胚乳、籽粒的RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究ZmMETS同源基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，這3個(gè)同源基因在玉米的各個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，ZmMETS1的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZmMETS2和ZmMETS3（圖4-A）。以根中表達(dá)為對(duì)照，ZmMETS1在莖和雌穗中表達(dá)量較高，在葉片中表達(dá)量較低（圖4-B）；ZmMETS2在莖、雌穗和胚乳中的表達(dá)量差異不明顯，而在葉、胚和籽粒中表達(dá)很低（圖4-C）；ZmMETS3在雌穗中表達(dá)量較高，在胚和籽粒中較低（圖4-D）。因此，推測(cè)ZmMETS1在植株的各個(gè)部位起主要作用。

圖4 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 in different tissues

2.3 萌發(fā)過程中ZmMETS的表達(dá)模式分析

將玉米B73自交系的種子在清水中浸泡36 h，下胚軸突破種皮，72 h時(shí)下胚軸長約1 cm。從浸種開始，ZmMETS1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于ZmMETS2和ZmMETS3（圖5-A）。ZmMETS1在12 h后表達(dá)量急劇增高，36 h達(dá)到高峰，然后下降為最高峰的1/2（圖5-B）；ZmMETS2在36 h內(nèi)表達(dá)量沒有明顯變化，然后下降為初始的1/10（圖5-C）；ZmMETS3的變化模式與ZmMETS1類似，12 h后急劇增高，36 h達(dá)到高峰，48 h表達(dá)量急劇下降，僅為最高峰的1/4，60 h又增高，達(dá)到24 h的水平，然后再緩慢下降（圖5-D）。這說明不同的同源基因在萌發(fā)中的轉(zhuǎn)錄模式不同。

圖5 ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS13在萌發(fā)過程中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expressions of ZmMETS1/ZmMETS2/ZmMETS3 during germination

3 討論

植物中甲硫氨酸合酶不僅催化從頭合成中的最后一個(gè)反應(yīng)，而且還用于甲基的重復(fù)再利用，其蛋白結(jié)構(gòu)是比較保守的［20，26］。前人開展的研究主要都集中在擬南芥和擬南芥基因在作物中的外源表達(dá)，而作物自身編碼基因的功能鮮見報(bào)道［10，25，27］。本試驗(yàn)從B73的葉片組織中分別克隆得到了ZmMETS的3個(gè)同源基因，Swiss-model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示它們編碼的蛋白N段具有典型的非依賴鈷胺素合酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C段具有典型的非依賴鈷胺素合酶催化結(jié)構(gòu)域，屬于甲硫氨酸合酶家族基因［26］，還需要進(jìn)一步的酶學(xué)試驗(yàn)證實(shí)。

ZmMETS同源基因的組織表達(dá)模式的共性在于它們?cè)诖扑胫械谋磉_(dá)水平較高，在其他部位則表達(dá)模式各自不同。ZmMETS1在各組織中的表達(dá)量均最高，只是在葉片中表達(dá)水平低一些，約為根中表達(dá)量的一半；ZmMETS2在葉片、胚和籽粒中的表達(dá)水平都只有根的15%；ZmMETS3在雌穗中的表達(dá)水平最高，在胚和籽粒中表達(dá)水平最弱。這個(gè)現(xiàn)象與在擬南芥中的觀察類似，擬南芥中AtMETS1轉(zhuǎn)錄水平總體很高，在花中的轉(zhuǎn)錄水平最高；不同的地方在于擬南芥3個(gè)同源基因的根部的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)其他部位來說很低；AtMETS2主要在莖中轉(zhuǎn)錄水平高，而AtMETS3主要在種子中轉(zhuǎn)錄［20］。這說明不同物種中甲硫氨酸合酶具體執(zhí)行的功能可能根據(jù)不同組織的甲基代謝與一碳代謝的需求而不同，其具體生物功能有待進(jìn)一步深入研究。

種子萌發(fā)過程中，一碳代謝與甲硫氨酸代謝都在發(fā)生劇烈的變化。豌豆萌發(fā)2 d時(shí)，葉酸含量是種子的2倍以上，HPPK/DHPS的mRNA豐度是初始的5倍［28］。玉米中主要變化的是5甲基四氫葉酸，2 d時(shí)5甲基四氫葉酸的含量相對(duì)是初始的1 000多倍，特別是4尾形式的葉酸占比顯著增加［29］。擬南芥中，萌發(fā)1 d時(shí)，甲硫氨酸的含量接近初始的2倍，AtMETS1是初始的25倍以上，然后緩慢下降，到48 h時(shí)為初始的5倍左右；AtMETS2和AtMETS3幾乎沒有變化，48 h時(shí)增加為初始的5倍左右［24］。玉米中ZmMETS同源基因在萌發(fā)過程中的表達(dá)模式不同于擬南芥中的觀察。盡管ZmMETS1是轉(zhuǎn)錄水平最高的基因，它和ZmMETS3隨時(shí)間的轉(zhuǎn)錄模式很類似，都是在萌發(fā)后轉(zhuǎn)錄水平急劇增加，36 h時(shí)達(dá)到高峰，然后下降；ZmMETS2轉(zhuǎn)錄水平在48 h顯著低于初始。這說明這3個(gè)同源基因可能參與的生物學(xué)過程有所不同，其調(diào)控機(jī)制差異需要進(jìn)一步詳細(xì)分析。

4 結(jié)論

玉米中存在3個(gè)具有組成型表達(dá)特征的玉米甲硫氨酸合酶基因，ZmMETS1可能在雌穗發(fā)育和萌發(fā)過程中起主要作用。