楊青青 唐家琪 張昌泉 高繼平 劉巧泉

（植物功能基因組學教育部重點實驗室 江蘇省作物基因組學和分子育種重點實驗室 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心 揚州大學農(nóng)學院，揚州 225009）

遺傳變異是農(nóng)業(yè)發(fā)展的基礎，農(nóng)作物育種的目的是創(chuàng)造和利用這些遺傳變異。在漫長的農(nóng)作物育種歷史中，育種方式經(jīng)歷了原始育種、傳統(tǒng)育種和分子育種三個時代的跨越，形成了具有典型時代特征的各種技術版本［1-2］。我國當下農(nóng)作物的育種方式主要包括傳統(tǒng)的常規(guī)育種、基于分子標記的輔助選擇育種和基于基因遺傳修飾的轉基因育種等。其中常規(guī)育種依賴育種家根據(jù)個人經(jīng)驗將所用育種材料的有利基因進行隨機組合，效率較低。而分子標記輔助選擇育種和轉基因育種通常針對個別性狀進行精確改良，效率較高。但是由于轉基因育種涉及產(chǎn)品商業(yè)化問題，所以目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要以分子標記為主［3］。眾所周知，生物性狀的遺傳調控是由眾多基因參與的復雜調控網(wǎng)絡。因此，農(nóng)作物品種的改良涉及一系列功能基因的利用，而高通量基因特異性分子標記的開發(fā)與利用將能更有效地促進農(nóng)作物品種的定向改良［4］。

隨著高通量測序技術的發(fā)展，目前DNA分子標記已經(jīng)發(fā)展到第三代。第一代是基于分子雜交技術的標記技術，包括限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）；第二代是基于PCR技術的分子標記技術，包括序列標志位點（sequence tagged sites，STS）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）、擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等；而單苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被稱為第三代分子標記：它是基于DNA芯片技術的一種分子標記技術。與第一、第二代分子標記相比，它具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好、二等位基因型等特點，因此，更容易實現(xiàn)高通量和自動化檢測［5］。近些年來，由于下一代測序（next generation sequencing，NGS）等技術的發(fā)展，促進了基于芯片的標記平臺的開發(fā)，各種高通量基因分型技術也被開發(fā)和利用起來［6］，如英國政府化學家實驗室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）基于競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）原理開發(fā)的KASP高通量SNP檢測技術［7］和美國富魯達公司（Fluidigm）基于微流體芯片技術開發(fā)的Fluidigm基因分型平臺［8］。其中KASP技術由于其高通量、低成本和可操作性強等優(yōu)點而在農(nóng)作物性狀遺傳和改良研究領域備受關注，現(xiàn)已發(fā)展成為全球基準技術［7］。本文主要從KASP技術的發(fā)展、原理和在水稻、小麥、玉米等主要農(nóng)作物的遺傳育種中的應用等方面展開綜述，同時展望了其在作物遺傳育種中的應用前景。

1 KASP技術的特點與實驗原理

1.1 KASP技術的發(fā)展與特點

在過去30年中，分子標記從低通量限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）開始，到最近達到的基于NGS技術的SNP標記，已經(jīng)經(jīng)歷了三代。KASP是一種基于熒光的同質基因分型技術，最初由英國的KBioscience公司所開發(fā)［7］。KBioscience公司成立于2002年，在優(yōu)化基因分型分析的相關技術以及KASP技術的開發(fā)方面擁有近10年的經(jīng)驗。他們不僅開發(fā)了一套自己的SNP基因分型儀器，而且擁有約500 000個經(jīng)過驗證的KASP分析庫存。隨后，該公司在2011年被英國的LGC公司收購。不久，LGC公司開發(fā)出了一套靈活、快速且高通量的SNPline儀器平臺和實驗方案，基于該公司的平臺，每天可檢測的SNP數(shù)量從20-500 000個，樣本數(shù)可從單個到數(shù)萬個以上，有很強的靈活性。

KASP技術具有靈活、便宜、準確等特點。一方面，它是以常規(guī)PCR和熒光檢測為基礎，能夠在普通實驗室操作的基礎上滿足低、中、高通量基因分型的要求。因此，具有一定的靈活性，更容易實現(xiàn)高通量和自動化檢測［7］。另一方面，KASP作為TaqMan的替代品，在原理上與TaqMan類似（也是基于終端熒光讀取判斷），但它與TaqMan技術的不同之處在于：其采用的是通用探針，可以與各種不同的基因特異引物配合使用，而不需要針對每個特定的位點進行探針合成，這極大降低了實驗的試劑成本［9］。研究表明，采用KASP技術的商業(yè)服務成本比采用TaqMan探針法低約80%［10］。其次，基于KASP技術的基因分型是一種簡單的不依賴于凝膠電泳檢測的方法，其不需要專門的設備，研究人員可以使用常規(guī)的qPCR儀器進行SNP基因分型，具有良好的兼容性。通過設計兩個引物對等位基因特異性單核苷酸多態(tài)性位點進行不同方向的擴增，可以將單核苷酸多態(tài)性轉化為長度多態(tài)性。此外，KASP實現(xiàn)了更高的分析設計成功率（98%-100%）和轉化為成功的工作檢測（93%-94%）（與TaqMan的72%和61%相比）（LGC Genomics應用說明：http://www.kbioscience.co.uk/reagents/KASP_TaqMancomparison.pdf）。而將KASP與基于芯片的Illumina GoldenGate平臺相比，KASP對陽性對照DNA樣品中的平均基因分型誤差為0.7%-1.6%，低于使用GoldenGate觀察到的（2.0%-2.4%），具有較高的準確性［7］。

從發(fā)展趨勢上看，高通量、低成本和操作友好型是分子標記技術發(fā)展的主要方向，而KASP檢測技術能夠同時滿足這3個要求。目前該技術已廣泛應用于植物、動物和人類的遺傳學研究與群體分型［11-13］。研究人員可以選擇幾種簡單的方法進行KASP分析，例如：可以直接向LGC公司或其他商業(yè)測試公司提供核酸樣本和引物進行檢測；或者通過訂購KASP試劑，自行利用qRT-PCR儀進行結果分析；又或者購買全套檢測設備，建立自己的高通量SNP分析平臺。

1.2 KASP技術的實驗原理與步驟

KASP是一種基于熒光檢測的基因分型技術，能夠在復雜的基因組DNA樣品中對特定位點上的SNPs和插入缺失（insertion-deletions，InDels）序列進行精準的雙等位基因檢測。具體的檢測體系包括：DNA模板、2個通用熒光探針、2個通用淬滅探針、2個與目標位點特異結合的引物以及共同的反向引物。該技術是基于引物末端堿基的特異匹配來對SNP以及InDel位點進行檢測，即基于PCR反應結束后的熒光讀取工作［10］。針對每個孔采用雙色熒光檢測，一個樣本對應一個檢測位點，而每個位點都存在3種可能的基因型（純合1，純合2或雜合），極大地提高了檢測效率。

KASP技術的操作步驟可概括為三大步：第一步，引物和探針設計。首先設計針對特定SNP的2個正向PCR引物，每個引物通過調整3′末端來對應一個SNP的等位基因［14］。例如圖1，等位基因1引物3′末端對應A，等位基因2引物3′末端對應C。其次，在每個正向引物的5′末端添加標簽序列，如圖1中的標簽序列1和2。此外，設計與標簽序列對應的熒光探針，如探針1和探針2。在探針1的5′端添加有FAM熒光基團，探針2的5′端添加有HEX熒光基團［15］。同時，對應2個探針，各設計一個3′端帶淬滅基團的淬滅探針。在實際操作中只需要針對特定SNP設計添加5′末端標簽序列的普通引物即可，而探針通常由試劑盒提供。第二步，普通PCR擴增。在第一輪PCR擴增中，等位基因特異引物（3′末端能配對的）就可識別特定等位基因模板，完成等位基因識別（圖1）。從第2輪PCR擴增開始，產(chǎn)物中出現(xiàn)攜帶通用標簽序列的模板，這步完成把通用標簽序列引入與SNP對應的PCR產(chǎn)物中。隨后在PCR擴增過程中，攜帶熒光的探針通過與通用序列互補的DNA鏈結合而添加到PCR產(chǎn)物中，經(jīng)多輪PCR擴增，更多的熒光探針退火到新合成的、沒有淬滅基團的互補鏈上，而逐漸增強PCR產(chǎn)物熒光強度。第三步，熒光檢測和分析。利用專用的熒光信號檢測儀或普通的熒光定量PCR儀（配有FAM和HEX檢測通道）進行信號讀取并用軟件采集信號和判別等位基因類型。

圖1 KASP技術基因分型的基本原理示意圖Fig.1 Principal of the KASP genotyping assay

2 KASP技術在主要農(nóng)作物中的應用

2.1 KASP技術在種質資源鑒定與親緣關系研究中的應用

種質資源是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基本的生產(chǎn)資料，是加速農(nóng)作物育種改良的重要物質基礎［16］。同時，種質資源在持續(xù)提高作物產(chǎn)量、品質和保證糧食安全等方面發(fā)揮著重要作用。種質資源的廣泛收集及妥善保存是確保種質資源遺傳多樣性最有效的方法之一［17］。由于KASP標記的高通量和低成本特性，近些年越來越多的研究利用該標記開展了種質資源的鑒定和應用分析。

在水稻中，Shikari等［18］采用KASP技術對克什米爾河谷的溫帶水稻種質資源的213個基因組位點進行了分析。通過消除冗余，最終選擇了114個SNPs設計成KASP標記。通過群體結構分析，將該批材料分成了3個明顯的亞群。Yang等［19］借助已有的SNPs和InDels數(shù)據(jù)庫，成功開發(fā)了565對與水稻重要農(nóng)藝性狀相關的KASP標記，并將其中多態(tài)性較好的467對標記用于481份水稻種質的群體結構分析。根據(jù)KASP標記基因分型結果，將該材料分為3個組群。此外，貴州禾是貴州省特有的一種原生態(tài)水稻品種，吳嫻等［20］利用120對KASP標記對貴州禾資源和一些其他地區(qū)的水稻品種的遺傳多樣性和群體結構進行了研究。結果表明，貴州禾的遺傳多樣性較為豐富，與貴州及江蘇地方粳稻的親緣關系更為密切。

在小麥中，謝靜敏等［21］設計了5 412對KASP標記對青海省一批小麥品種進行了遺傳多態(tài)性分析。結果顯示KASP標記多態(tài)性比率為90.4%，多態(tài)性結果顯示該批小麥品種可分為5個或12個類群。Federico等［22］用85對KASP標記對168份來自阿根廷和其他國家的硬粒小麥的遺傳多樣性進行分析，得出遺傳分化系數(shù)值為0.139。這些品種可被分為兩個亞群，并且發(fā)現(xiàn)其分析結果與119份材料中使用AFLP標記分析所獲得的信息是互補的。Zhang等［23］將與小麥籽粒產(chǎn)量、品質、適應性和抗逆性有關的44個SNPs開發(fā)成KASP標記，進而對207份面包小麥品種進行群體結構分析，將其分為兩個亞組：第一亞群主要指寧夏的地方品種和栽培品種；第二類主要是從國外和中國其他省份引進的品種。

在玉米中，陸海燕等［24］利用不同來源的玉米自交系全基因組重測序數(shù)據(jù)鑒定出了一系列SNPs位點并開發(fā)出700對KASP分子標記，從中選擇202對具有代表性KASP標記進一步用于系統(tǒng)進化樹構建及群體結構分析。結果顯示，基于KASP標記位點的聚類分析結果和基于總SNPs位點的聚類分析結果高度吻合，兩者的遺傳距離相似性系數(shù)高達89.5%，能成功區(qū)分玉米的雜種優(yōu)勢群。因此，KASP標記亦可在玉米種質資源分析、以及雜種優(yōu)勢群劃分等方面發(fā)揮重要作用。

在其它農(nóng)作物方面，Yang等［25］選擇了53對KASP標記對34份大白菜材料進行基因分型，這53對標記平均分布在每條染色體上。通過對該批材料的遺傳多樣性的評估，可將這34份材料根據(jù)抽穗類型分為三大類。Shen等［26］通過對西蘭花基因型進行全基因組測序，選擇了100個SNPs用于KASP標記的開發(fā)。隨后利用這些標記對372份西蘭花材料進行群體結構分析，發(fā)現(xiàn)這些材料可分為兩個主要類群，但類群分化相對較弱。王富強等［27］使用一批葡萄種質篩選出46對優(yōu)質KASP標記。而其中的25對標記即可對這些材料進行有效區(qū)分，鑒定效率達到95.69%。聚類分析結果顯示可將該批葡萄種質細分為6個亞類。Wang等［28］利用成功開發(fā)的78對（轉化率為61.41%）KASP標記將94份小扁豆材料分為兩個主要類群：國內種質和國外種質，并且發(fā)現(xiàn)國內種質的聚類更為集中，而國外種質的分布則更為廣泛。這與使用EST-SSR標記的分類結果高度一致。此外，KASP技術還被用于咖啡［29］、花生［30］等農(nóng)作物的種質資源鑒定和親緣關系等方面的研究。

2.2 KASP技術在分子標記輔助育種中的應用

傳統(tǒng)育種一般是通過對群體中大量個體進行性狀觀測來選育優(yōu)良后代，這一過程不僅操作繁瑣、耗費時間，而且效率低下。隨著分子生物技術的快速發(fā)展，分子標記輔助選擇已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的有效工具［31-32］。在眾多的分子標記中如何選擇高通量且低成本的分子標記是現(xiàn)代分子標記輔助育種研究中所首要關注的。基于KASP標記在成本和通量方面的優(yōu)勢，其在農(nóng)作物的標記輔助選擇育種中也得到了廣泛應用。

在水稻中，Shao等［33］基于水稻基因組計劃（rice genome project，RGP）的3 000份重測序數(shù)據(jù)，對控制稻米直鏈淀粉含量的Wx基因開展了等位變異分析，并成功開發(fā)了6對KASP標記，這些標記大致能夠區(qū)分現(xiàn)有的所有Wx等位基因材料。他們利用這些標記對1976-2018年的雜交親本品種進行了Wx基因分型發(fā)現(xiàn)，雜交稻親本中主要存在3種Wx等位類型：Wxa、Wxb和Wxlv。Wxb廣泛應用于雜交水稻的父本；Wxa和Wxlv用于早期雜交稻的母本，并隨著雜交稻的選育進程，逐漸被Wxb所取代。另外，根據(jù)Wxmq基因第4外顯子的SNPs信息，牛付安等［34］開發(fā)了Wxmq-KASP，用其對一些粳稻軟米品種和相關F2群體進行了基因分型研究，證明Wxmq-KASP可以高效應用于水稻低直鏈淀粉含量的分子標記輔助選擇育種。Addison等［35］對2 932份水稻品種的香味基因Badh2的SNPs進行了分析，開發(fā)出能區(qū)分Badh2單倍型的9對KASP標記，并對一些美國水稻材料進行檢測，發(fā)現(xiàn)Hap6能夠有效鑒定美國種質中的香味品種。同年，Li等［36］開發(fā)了兩對與Badh2-E2（第2外顯子的7 bp缺失）和Badh2-E7（第7外顯子8 bp缺失及3 bp變異）等位基因變異相關的KASP-SNP標記，并將其應用于香稻種質鑒定和F2群體篩選。結果發(fā)現(xiàn)，164份香米品種中有160份可以使用這兩對標記進行鑒定，并推測大多數(shù)香米品種攜帶Badh2-E2和Badh2-E7兩種等位類型。李瑤等［37］開發(fā)了SKC1NB（耐鹽性）-KASP，利用該標記對一個BC3F2群體進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其能夠有效區(qū)分群體中純合個體和雜合個體。此外，在抗病性方面，一些研究證明KASP標記能夠很好地鑒定水稻材料中抗病基因的不同等位基因類型［38-41］。

在小麥方面，KASP技術多用于與小麥抗病性和抗非生物脅迫相關的基因方面的研究。例如，Rasheed等［42］開發(fā)并鑒定了152對與普通小麥適應性、產(chǎn)量、品質、生物和非生物脅迫抗性相關的KASP標記，并利用這些標記對4個小麥分離群體的基因型進行鑒定，結果顯示所有的KASP標記都與栽培品種以及雙親群體中的相關表型顯著關聯(lián)。該研究還發(fā)現(xiàn)KASP標記的檢測效率是基于凝膠電泳的傳統(tǒng)PCR標記的45倍，并且能有效提高雜交親本和高代品系的鑒定效率。2018年，Qureshi等［43］借助20對KASP標記證實了小麥抗條銹病Yr34和Yr48為同一個基因。而在這之后，F(xiàn)ang［44］就小麥抗葉銹基因Lr34開發(fā)了兩對KASP標記：Lr34-E11-KASP和Lr34-E22-KASP，這兩對標記可在小麥育種工程中加速對Lr34基因的選擇。Rehman等［45］選擇與小麥耐旱性相關的16個基因座的等位基因開發(fā)了KASP標記，對47份小麥材料進行了等位變異與籽粒產(chǎn)量的相關性分析。該批KASP標記的轉化率＞98%，并且其對材料的分析結果與基于凝膠的PCR標記的分析結果一致。此外，王志偉等［46］利用3對抗旱基因的KASP標記（TaDreb_SNP、fehw3_SNP、CWI4A_SNP）和3對抗穗發(fā)芽基因的KASP標記（PHS_646、SDR_SNP、Vp1b1-83_IND）對云南育成的小麥品種（系）進行了基因型檢測，發(fā)現(xiàn)這6對標記能夠有效區(qū)分抗穗發(fā)芽和易穗發(fā)芽的品種以及抗旱和非抗旱品種。Su［47］就小麥赤霉病（fusarium head blight，F(xiàn)HB）開發(fā)了TaHRC-KASP標記，并對來自中國和日本的幾個抗赤霉病的地方品種進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在不同背景下，TaHRC-KASP標記均可鑒定Fhb1基因。另外，Khalid等［48］利用124對KASP標記，對一批六倍體小麥品系進行分析，以研究87個具有育種價值的功能基因的等位變異規(guī)律。從而為進一步調控小麥重要農(nóng)藝性狀的表達提供了一套目標基因。Anuarbek等［49］利用32對KASP標記分析了來自哈薩克斯坦的四倍體硬粒小麥材料，并對主要農(nóng)藝性狀進行評估，發(fā)現(xiàn)其中有8對KASP標記的檢測結果與小麥的5個農(nóng)藝性狀顯著相關。

在玉米方面，Jagtap等［50］開發(fā)了100對與高溫脅迫響應（heat stress response，HSR）有關基因的KASP標記，發(fā)現(xiàn)其中71%的標記具有多態(tài)性，21%的標記只產(chǎn)生一種基因或只有雜合型基因，其余的8%未能產(chǎn)生有用的擴增信號。通過比較，發(fā)現(xiàn)該研究中的KASP標記開發(fā)有效率（71%）高于小麥［51］（67%）和水稻［52］（49.9%），但低于鷹嘴豆［11］（80.6%）。此外，BoлкoBa等［53］以玉米為例，介紹了KASP基因分型的結果及其在遺傳育種和種子生產(chǎn)中的應用，證明通過KASP基因技術進行的基因組選擇能夠有效提升玉米抗旱性遺傳改良。

在其它作物中，Ongom等［54］利用開發(fā)的17個豇豆KASP標記對225個雜交組合產(chǎn)生的1 436個F1代植株進行了分子指紋圖譜和雜合性檢測，結果表明KASP標記能夠對缸豆親本和雜合體有效區(qū)分，為缸豆的分子育種提供了重要信息。王鵬等［55］設計了抗番茄黃花曲葉病毒病基因Ty-1和抗根結線蟲基因Mi-1的KASP標記，并結合已報道的抗番茄花葉病毒病基因Tm-22、抗番茄斑萎病毒病基因Sw-5和抗鐮刀菌頸腐根腐病基因Frl的KASP標記，進行了番茄抗病基因KASP分型檢測，所得檢測結果與傳統(tǒng)分子標記檢測結果一致。張敬敬等［56］開發(fā)了西瓜抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病性狀相關的3對KASP，對130份西瓜材料進行了分析，根據(jù)檢測結果將試驗材料分為攜帶不同抗病基因的4類。棕色中脈（bmr）表型是高粱的一種隱性性狀，會導致木質素的總體減少［57］。Burow等［58］開發(fā)了15對KASP標記（6對用于bmr6，9對用于bmr12），用于在高粱苗期對bmr6和bmr12的等位變異進行研究。因為bmr6和bmr12表現(xiàn)出隱性上位型基因互作，因此，這些KASP標記有助于從單個突變體中鑒定出雙突變類型。孟君仁等［59］利用5對KASP標記對桃的自然群體和分離群體進行了檢測，表明開發(fā)的KASP標記可高效檢測桃果實外觀、抗性、肉質等重要性狀相關基因的等位變異。此外，KASP技術在馬鈴薯［60］、蘋果［61］、辣椒［62］和向日葵［63］等作物中也進行了相關的育種研究。

2.3 KASP技術在遺傳圖譜構建與基因定位中的應用

遺傳圖譜的構建是基因定位和克隆的前提，其在數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）的遺傳鑒定中發(fā)揮關鍵作用［64-65］。早期的遺傳圖譜構建所采用的分子標記主要是第一代和第二代分子標記，由于這些分子標記在基因組中分布密度較低，基于這些標記所定位到的QTL往往因為精度有限而無法開展后續(xù)的QTL精細定位和克隆。近些年來，隨著技術的進步和測序成本的降低，大規(guī)模重測序已經(jīng)成為可能。利用廣泛的重測序可以挖掘大量的遺傳標記，這為構建高密度遺傳圖譜提供了強有力的數(shù)據(jù)支持［66］。其中SNP陣列是一種強大而有效的QTL作圖方法，而KASP技術作為SNP標記基因分型的一種，能夠在保證基因分型準確性的情況下，大大節(jié)省實驗所消耗的時間［6］。

在水稻方面，Cheon等［67］開發(fā)了771對KASP標記并成功地用于韓國溫帶粳稻品種的遺傳圖譜構建和抗病性及穗發(fā)芽抗性的QTL分析。其中，利用239對KASP標記對包含160個系的重組自交系（RIL）進行了抗穗發(fā)芽的QTL檢測。Ghosal等［68］通過所構建的兩個F2水稻群體，分別獲得了170個和179個多態(tài)性SNPs，并將這些位點設計成KASP標記進行檢測，共鑒定出5個分別位于染色體3、5、6、7和8上的與存活率有關的QTL，以及4個分別位于染色體1、3和7上的控制幼苗高度的QTL。有氧水稻生產(chǎn)（aerobic rice production，AP）是減少水稻栽培用水的有效方式，具有窄根錐角（narrow root cone angle，RCA）基因被認為是AP的一個關鍵特征。研究表明，qRCA4對于RCA變異起重要作用［69］。Vinarao等［70］構建了3種不同遺傳背景的水稻F2群體，利用9對KASP標記（其中兩對標記：snpOS00933和snpOS00944被設計用于QTL兩側，而另外7對標記被設計在QTL內），最終將qRCA4精細定位在720 kb的區(qū)域內。另外，Lei等［71］在7號染色體上檢測到一個與相對地上部長度（RSL）相關的主效QTL：qRSL7，并根據(jù)親本之間的SNP，在QRSL7附近開發(fā)了25對KASP標記，最終將QRSL7定位在222 kb的距離內。

在小麥方面，蔣鈺婕等［72］用小麥無芒品種中國春為父本，有芒品系MK147為母本構建了F2分離群體，利用58對KASP標記將控制芒的QTL定位在0.81 cM的區(qū)間內。Zhan等［73］利用20對KASP標記對小麥品種T.ponticum × Taichung 29的F2分離群體，進行抗小麥白粉病基因PmCH7087的定位分析，最終將目標基因定位在9.68 Mb的區(qū)間內。Xiong等［74］利用突變體eh1和LX987雜交獲得的RIL進行遺傳作圖，檢測到37個與抽穗期、株高、千粒重、穗長等農(nóng)藝性狀有關的QTL，并利用成功開發(fā)的25對KASP標記對這些QTL進行了驗證，從而將染色體4B和3A上的QTL分別限定在0.8 Mb和2.5 Mb的物理間隔內。通過將KASP技術與構建遺傳圖譜相結合，Wu等［75-76］分別利用17對和18對KASP標記在染色體2BS、3BS和6BL上鑒定了3個與抗條銹病性相關的QTL，并將6BL染色體上的QTL最終定位在KASP標記IWB71602和IWB55937之間，其遺傳距離為1.4 cM。

在玉米方面，Nair等［77］利用KASP標記技術對CML206 × CML312的F2群體，進行玉米條紋病抗性基因Msv1的精細定位，定位區(qū)間為0.87 cM。玉米致死性壞死（maize lethal necrosis，MLN）是撒哈拉以南非洲地區(qū)玉米的一種主要疾病，嚴重感染時，產(chǎn)量損失可達 100%［78］。對此，Awata等［79］開發(fā)了500對可能影響MLN表型的KASP標記，通過對7個群體的F3后代進行分析，檢測到了至少有7個抗MLN的QTL。其中，3號染色體上的2個SNP位 點（PHM15449_10和 PZA00920_1） 與 MLN抗性密切相關。此外，Wang等［80］在3號染色體上發(fā)現(xiàn)了與高莖稈斷裂角度（影響莖稈的柔韌性和抗倒伏性）有關的2個候選基因：Zm00001d039769和Zm00001d039913，根據(jù)這2個候選基因設計的2對KASP標記，經(jīng)過驗證也顯示出與莖稈斷裂角度有顯著的相關性。

在其它作物方面，Kante等［81］構建了西非高粱的 POPCD（CK60A × DT-298）、POPFD（FambeA ×DT-298）和 POPFL（FambeA × Lata）的 3 個 F2分離群體，鑒定了7個與育性恢復基因Rf相關的QTL，并利用開發(fā)的11對KASP標記在POPCD和POPFL的F2：3群體中進行了QTL位點的驗證。Cheng等［82］通過遺傳作圖在6號染色體上檢測到與大豆鐮刀菌抗性有關的3個抗性候選基因，針對其中一個基因（Glyma.06g206900）設計了KASP標記并在不同遺傳群體中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)該標記與病原菌反應之間存在著很強的相關性。提高水分利用效率可以有效減少干旱脅迫造成的生產(chǎn)損失，為了確定蘋果中與調控水分利用效率有關的位點，Wang等［83］利用Honeycrisp和Qinguan兩個品種構建的F2群體進行了干旱脅迫QTL的鑒定，隨后用開發(fā)的3個KASP標記對其中的3個QTL進行了穩(wěn)定性驗證。Scholten等［84］利用1 100對KASP標記對所構建的洋蔥種間三交群體進行基因分型，最終將鱗狀葡萄孢桿菌（botrytis squamosa）的抗性位點定位于6號染色體上。此外，KASP技術還被用于大白菜［85］、花生［86］等農(nóng)作物在遺傳圖譜構建與基因定位中的研究。

2.4 KASP技術在種子純度鑒定中的應用

傳統(tǒng)上對種子純度的鑒定主要依賴于表型鑒定，效率低下。隨著DNA分子標記技術的不斷發(fā)展，越來越多的作物開始使用不同類型的分子標記來鑒別種子的真?zhèn)魏图兌龋?7］，但AFLP、SSR、InDel等標記存在數(shù)量少、操作復雜等不足。而SNP標記具有穩(wěn)定性好、密度高、分布廣泛、適于規(guī)?；Y選等優(yōu)點，已被應用于辣椒、黃瓜等作物的品種鑒定以及種子純度檢測等方面［88-90］。目前KASP標記技術在種子純度鑒定方面也得到了越來越多的應用（表1）。

表1 KASP技術在主要農(nóng)作物中的應用Table 1 Application of KASP technology in crops

Ertiro等［91］使用了191對KASP標記和257 268對GBS（genotyping by sequencing，通過測序進行基因分型）標記對來自玉米品種的16個自交系的2-9個種子源的遺傳純度和同一性水平進行了評價分析。研究結果表明基因分型平臺的類型和用于分析的標記數(shù)量對于不同來源的種子純度及同一性方面均存在一定差異，但兩種方法得出的總體結論基本相似。說明相較于高標記密度的GBS技術，使用低標記密度的KASP技術就可輕松完成材料的質控分析。此外，尹祥佳等［92］采用KASP技術對甘肅省內推廣的6份玉米雜交種進行了純度鑒定，結果顯示4對KASP標記對品種的純度鑒定結果在95.83%-98.96%。王蕊等［93］篩選獲得在玉米染色體上分布均勻、多態(tài)性較好的60個候選位點，并轉化為KASP標記，轉化成功率為95%。綜合考慮標記雙親互補率、多態(tài)性、穩(wěn)定性和分型效果等多項指標，最終確定20個標記作為玉米雜交種純度鑒定的核心標記，這些標記能夠有效鑒定99.7%供試樣品純度。馮子珊等［94］利用3對KASP標記對短棒瓠瓜雜交種的92份F1及其父、母本材料進行了分析，結果顯示F1種子純度為97.8%，與田間種植純度鑒定結果一致?？锩偷龋?5］利用棉花63K全基因組SNP芯片對代表性品種進行了篩選與綜合評估，并基于KASP技術開發(fā)了一套適用于我國棉花雜交種純度高通量檢測的核心SNP組合（合計26個），從而實現(xiàn)了對大量樣品的品種純度的快速檢測。為了確定大麥預混麥芽樣品“麥特卡夫”的樣品純度，蔣培基等［96］篩選鑒定了4個能夠區(qū)分7個大麥麥芽品種的SNP位點，開發(fā)了對應的KASP標記。進一步的分析表明這些標記能夠成功分辨出預混麥芽樣品。此外，Kim等［97］使用50對KASP標記在102個蘿卜自交系中進行品種純度驗證發(fā)現(xiàn)，這些自交系的純合性在56%-96%。

3 展望

隨著分子生物學和高通量測序技術的發(fā)展，越來越多的農(nóng)作物品種和品系的基因組重測序使得SNP標記日益豐富?；谶@些豐富的SNP數(shù)據(jù)，以SNP芯片陣列和重測序SNP分型技術為主的基因分型平臺得到了快速發(fā)展［98-99］。KASP作為目前主要的SNP分型檢測技術之一，相較于傳統(tǒng)的分子標記（RFLP，STS、SSR等）有其獨特的優(yōu)勢［7，100］。它是一種簡單的無凝膠熒光聚合酶鏈式反應，能夠在普通實驗室操作的基礎上滿足低、中、高通量基因分型的要求，具有一定的靈活性，適用于目標位點和樣本數(shù)量變化很大的實驗設計。此外，相較于其他的SNP基因分型平臺如：TaqMan和Illumina GoldenGate，它又能很大程度上降低實驗成本以及提高實驗準確率。該技術目前已在農(nóng)作物分子標記輔助育種、種質資源鑒定、遺傳圖譜構建和種子純度鑒定等領域得到了廣泛的利用。

從分子標記的利用看，傳統(tǒng)的SSR等標記仍然是大多數(shù)研究者常用的標記技術［101］。究其原因，雖然現(xiàn)有SNP數(shù)據(jù)非常豐富，但是這其中包括了大量冗余信息，研究人員很難快速準確的獲得有用的SNP信息。其次，大量的SNP信息還難以與功能基因位點關聯(lián)，這限制了其在以功能基因利用為主的遺傳育種中的應用［19］。就技術本身而言，由于SNP位點的限制，在KASP引物設計時會受到SNP附近序列的限制而造成所設計的引物無法有效進行PCR擴增［14］。此外，模板DNA質量的高低對于KASP檢測成功率也有重要影響。因此，為了提升KASP技術的利用效率，在基礎研究領域應當注重基因功能位點的收集和匯總，建立相關功能基因多態(tài)性位點的KASP數(shù)據(jù)庫。為提高KASP對未知樣本的檢測效率，在開發(fā)功能性KASP標記的同時，應當建立相配套的陽性對照標準品。從KASP技術的具體操作來看，實驗室小規(guī)模檢測條件下應當保證模板DNA的質量并調整到相似的濃度。當前分子設計育種已經(jīng)被作為一項高效和精準的育種技術手段，而在多種作物中被提出和實施。隨著功能基因序列信息的積累和KASP分子標記數(shù)目的增加，該技術將成為種質資源鑒定、群體分析和分子設計育種等研究的重要輔助手段。