宋紹霏，侯園園，王云雷，張通,2

1.首都醫(yī)科大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，北京市 100068；2.中國康復(fù)研究中心北京博愛醫(yī)院神經(jīng)康復(fù)科，北京市100068

0 引言

晝夜節(jié)律廣泛存在于各種生物生理活動(dòng)中。內(nèi)源性晝夜節(jié)律由位于下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的中央時(shí)鐘，以及外周器官、組織和細(xì)胞中的外周時(shí)鐘組成的多振蕩器系統(tǒng)產(chǎn)生[1]。在哺乳動(dòng)物中，SCN 接受來自視網(wǎng)膜的光照信號(hào)，將信號(hào)傳遞給大腦其他區(qū)域及外周各組織器官，從而使得中央時(shí)鐘產(chǎn)生的內(nèi)源性節(jié)律與外部環(huán)境的24 h節(jié)律同步[2]。由于SCN依賴于視網(wǎng)膜光照信號(hào)輸入實(shí)現(xiàn)與外部環(huán)境節(jié)律同步，通過調(diào)節(jié)光周期可誘導(dǎo)晝夜節(jié)律相位移動(dòng)，造成晝夜節(jié)律紊亂(circadian misalignment,CM)。倒班工作、時(shí)差等誘發(fā)CM 對(duì)生理功能存在影響[3]，會(huì)導(dǎo)致糖耐量受損，影響正常葡萄糖代謝[4-5]。

骨骼肌是胰島素刺激糖代謝的主要部位之一，負(fù)責(zé)約70%～80%胰島素刺激下葡萄糖攝取[6]；骨骼肌胰島素抵抗是代謝綜合征的早期表現(xiàn)之一。CM 影響骨骼肌葡萄糖攝取與利用[7]。骨骼肌特異性缺失Bmal1可觀察到葡萄糖攝取減少，葡萄糖氧化減少[8]；在Per2缺失小鼠跑步耐力顯著降低，糖酵解相關(guān)酶表達(dá)上調(diào)[9]。這些研究表明，時(shí)鐘基因與骨骼肌葡萄糖攝取和代謝有關(guān)。

本研究團(tuán)隊(duì)既往發(fā)現(xiàn)，通過異常光周期造模所致CM 會(huì)導(dǎo)致大鼠焦慮、抑郁[10]以及認(rèn)知功能下降[11]。本研究通過異常光周期對(duì)大鼠進(jìn)行CM 造模，模擬倒班工作人群CM，探討CM 對(duì)腓腸肌葡萄糖攝取及代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性4 周齡Wistar 大鼠雄性4 周齡Wistar 大鼠36只購買于北京維通利華技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXΚ(京)2016-0011。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXΚ(京)2018-0003。自由攝取食物和水。大鼠隨機(jī)等分為兩組：晝夜節(jié)律正常(circadian alignment,CA)組和CM組，每組18只。

實(shí)驗(yàn)操作符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》、《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則》的要求。所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.AEEI-2019-185)。

兩組大鼠飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境后，CA組采用12 h光照/12 h 黑暗的正常光照周期，即8:00 至20:00 處于光照狀態(tài)，20:00至次日8:00處于黑暗狀態(tài)；CM 組采用輪替12 h 光照/12 h 黑暗，即第1～3 天8:00 至20:00 光照，20:00 至次日8:00 黑暗，第4～6 天8:00 至20:00 黑暗，20:00至次日8:00光照，依此循環(huán)15次，共90 d。

從造模第61 天起，行ClockLab 行為學(xué)檢測(cè)18 d；第85天9:00行糖耐量試驗(yàn)，并測(cè)量其體質(zhì)量、體長(zhǎng)和腹圍；第91～92 天，于8:00、12:00、16:00、20:00、24:00、次日4:00 六個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取腓腸肌組織經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備檢，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)。

1.2 ClockLab行為學(xué)檢測(cè)

造模第61 天每組隨機(jī)取12 只大鼠進(jìn)行ClockLab行為分析18 d。采用基于MATLAB 的ClockLab 2.7.3軟件包形成晝夜節(jié)律活動(dòng)圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Chisquared Periodogram軟件包計(jì)算節(jié)律周期和振幅。

1.3 腹腔注射糖耐量試驗(yàn)[12-13]

每組隨機(jī)取12 只大鼠禁食12 h 后，在造模第85天9:00 行糖耐量試驗(yàn)。腹腔注射50%葡萄糖溶液2 g/kg，于注射前(0 min)以及注射后15 min、30 min、60 min、90 min 和120 min 尾靜脈采血，血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)測(cè)定血糖，計(jì)算血糖曲線下面積(area under curve,AUC)。

1.4 生理指標(biāo)測(cè)量

糖耐量試驗(yàn)后測(cè)量大鼠體質(zhì)量、腹圍(平劍突與后肢間垂直距離中點(diǎn)的周長(zhǎng))、體長(zhǎng)(從鼻尖到肛門的距離)[14]，并計(jì)算Lee指數(shù)[15-16]。

1.5 RT-qPCR

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組取3 只大鼠，麻醉后斷頭處死，快速切取腓腸肌，液氮速凍后-80 ℃儲(chǔ)存。

使用Trizol 法提取腓腸肌組織RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，F(xiàn)SQ-301)配制逆轉(zhuǎn)錄體系，合成cDNA。熒光定量試劑盒(Qiagen，208054)以及Quant-StudioTM3 Real-time PCR 系統(tǒng)(美國APPLIED BIOSYSTEMS 公司)行PCR 檢測(cè)，以內(nèi)參β-actin 標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

Bmal1引物：上游5'-ACC AAC CCA TAC ACA GAA GC-3'；下游5'-GAC AGA TTC GGA GAC AAA GAG G-3'。

Clock引物:上游5'-CAC GTT CAC TCA GGA CAG AC-3'；下游5'-TGG CAA AAG TAG GAT AGG CAG-3'。

Per2引物:上游5'-AAA TCC ACC GGC TAC TGA TG-3'；下游5'-TCC TCT TGA CCA TTG CTG TC-3'。

Tbc1d1引物:上游5' -AGC CAA AGG ATG TGC CCT AC-3'；下游5'-AAG TGA CAG CTG ACC TGC TC-3'。

Pgc1α引物:上游5'-CAG GCA GTA GAT CCT CTT CAA G-3'；下游5'-CTT CAT AGC TGT CAT ACC TGG G-3'。

Glut4引物:上游5'-TTC TGT TGC CCT TCT GTC C-3'；下游5'-ACT TCC GTT TCT CAT CCT TCA G-3'。

β-actin 引物:上游5'-CAC TTT CTA CAA TGA GCT GCG-3'；下游5' -CTG GAT GGC TAC GTA CAT GG-3'。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0 和Graphpad 7.0。計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以()表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，各時(shí)間點(diǎn)PCR數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 活動(dòng)休息節(jié)律

與CA 組相比，CM 組節(jié)律周期顯著延長(zhǎng)(P＜0.001)，節(jié)律振幅下降(P＜0.05)。見表1。

表1 ClockLab行為學(xué)分析結(jié)果

2.2 腹腔注射糖耐量試驗(yàn)

與CA 組相比，CM 組AUC 增加(P＜0.05)；注射后15 min、30 min、60 min、90 min，CM 組血糖升高(P＜0.05)。見表2。

表2 腹腔注射糖耐量試驗(yàn)兩組血糖及AUC比較

2.3 生理指標(biāo)

兩組體質(zhì)量、腹圍、體長(zhǎng)、Lee 指數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。見表3。

2.4 RT-qPCR

腓腸肌Bmal1、Clock、Per2、Tbc1d1、Pgc1α、Glut4mRNA 表達(dá)時(shí)間效應(yīng)顯著(P＜0.05)，Bmal1、Per2、Tbc1d1、Pgc1αmRNA 表達(dá)組間效應(yīng)顯著(P＜0.05)。與CA 組相比，4:00、8:00 時(shí)，CM 組Bmal1明顯降低(P＜0.01)，16:00 時(shí)升高(P＜0.05)；16:00、20:00 時(shí)，CM 組Per2表達(dá)降低(P＜0.05)；20:00、24:00時(shí)，CM 組Pgc1α表達(dá)降低(P＜0.05)，8:00 時(shí)表達(dá)升高(P＜0.05)；4:00、12:00 時(shí)，CM 組Glut4表達(dá)升高(P＜0.05)，24:00表達(dá)降低(P＜0.05)；4:00、24:00時(shí)，CM 組Tbc1d1表達(dá)降低(P＜0.01)。CM 組24 hTbc1d1總表達(dá)量顯著低于CA組(P＜0.001)。見表4～表9。

表4 腓腸肌Bmal1 mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

表5 腓腸肌Clock mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

表6 腓腸肌Per2 mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

表7 腓腸肌Tbc1d1 mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

表8 腓腸肌Pgc1α mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

表9 腓腸肌Glut4 mRNA 表達(dá) 單位：2-ΔΔCt

3 討論

本研究顯示，異常光周期導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)CM，造模成功；暴露于異常光周期的大鼠糖耐量下降，腓腸肌Bmal1、Per2、Tbc1d1、Pgc1α基因表達(dá)節(jié)律紊亂，Tbc1d1表達(dá)下降。這可能是CM 影響大鼠腓腸肌葡萄糖攝取的重要途徑。

本組CM 大鼠空腹血糖僅輕微升高，但糖耐量受損，出現(xiàn)胰島素抵抗。一項(xiàng)研究報(bào)道[17]，異常光周期所致CM 導(dǎo)致小鼠血糖AUC增加，糖耐量下降；另一項(xiàng)研究報(bào)道[18]，異常光周期所致CM 導(dǎo)致雌性大鼠腹腔注射葡萄糖20 min后血糖升高，糖耐量下降。與本研究結(jié)果一致。CM 對(duì)餐后血糖水平的影響大于空腹血糖水平[19]，與本研究結(jié)果一致。CM 對(duì)內(nèi)源性葡萄糖生成沒有影響，但骨骼肌胰島素敏感性下降，提示CM影響骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取和利用[7]。

Bmal1、Clock和Per2是核心時(shí)鐘基因[20]，Clock和Bmal1的轉(zhuǎn)錄可激活Per2轉(zhuǎn)錄；Per2可通過抑制Clock和Bmal1的活性抑制其自身表達(dá)，形成反饋回路[21]。Bmal1可以通過影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)表達(dá)和膜移位，調(diào)節(jié)肌肉葡萄糖攝取[22-23]。骨骼肌特異性缺失Bmal1小鼠糖耐量降低，葡萄糖利用受損[24]。Per2參與骨骼肌運(yùn)動(dòng)功能和能量代謝途徑的調(diào)節(jié)[25]。本研究顯示，大鼠腓腸肌Bmal1、Clock、Per2不同時(shí)間mRNA 表達(dá)均存在差異，與之前相關(guān)研究結(jié)果一致[26-27]；本研究還發(fā)現(xiàn)兩組大鼠腓腸肌Bmal1和Per2mRNA 表達(dá)節(jié)律存在差異，Clock表達(dá)節(jié)律無組間差異。清晨CM 組Bmal1表達(dá)下降，16:00 CM 組Bmal1表達(dá)變化趨勢(shì)與CA 組相反，CM組表達(dá)峰值后移。下午和黃昏時(shí)CM 大鼠Per2表達(dá)下降，也與CA 組的變化趨勢(shì)相反，CM 組表達(dá)峰值前移。

值得注意的是，CM 組Tbc1d124 h mRNA 表達(dá)顯著下降，并且節(jié)律發(fā)生改變。TBC1D1 是骨骼肌中胰島素和收縮刺激下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)因子，其不同突變可降低骨骼肌中胰島素和收縮刺激下的葡萄糖攝取[28-29]，是葡萄糖攝取的關(guān)鍵調(diào)控因子[30-31]，其mRNA表達(dá)下降影響骨骼肌葡萄糖攝取能力[32]，出現(xiàn)骨骼肌糖代謝紊亂。骨骼肌Bmal1缺失小鼠觀察到Tbc1d1振蕩和表達(dá)水平降低[33]，與本研究結(jié)果一致。提示CM大鼠Bmal1表達(dá)節(jié)律改變可能與Tbc1d1表達(dá)下降有關(guān)，未來可進(jìn)一步研究。

Clock、Per2目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道其與Tbc1d1的關(guān)系，本研究中Per2的節(jié)律異常是否也與Tbc1d1表達(dá)下降有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

GLUT4 是調(diào)節(jié)肌肉攝取葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[34]。骨骼肌特異性敲除Bmal1基因可導(dǎo)致骨骼肌Glut4mRNA 表達(dá)下降[26,35]。本研究中，4:00、12:00和24:00，兩組腓腸肌Glut4mRNA 表達(dá)有差異，但兩組Glut4總表達(dá)量無顯著性差異。這可能由于Bmal1對(duì)Glut4表達(dá)的調(diào)節(jié)僅發(fā)生在某些時(shí)間點(diǎn)，導(dǎo)致糖耐量受損。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ 協(xié)同激活因子-1α(peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α,PGC1α)是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，調(diào)節(jié)參與能量代謝的基因和線粒體蛋白[36-37]，通過上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4 來增加葡萄糖在肌肉中的攝取[38]。雖然實(shí)驗(yàn)中其24 h mRNA 總表達(dá)量?jī)山M間無顯著性差異，但觀察其統(tǒng)計(jì)圖可以看出CM 組Pgc1α振蕩和表達(dá)水平已有明顯下降趨勢(shì)，雙因素方差分析顯示組間效應(yīng)顯著。在骨骼肌中，PGC1α 受到營養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)刺激的調(diào)節(jié)[9]。本研究中，由于CM 大鼠飲食和運(yùn)動(dòng)節(jié)律改變，可能與Pgc1α節(jié)律的改變有關(guān)；Pgc1α的表達(dá)改變也說明CM 大鼠葡萄糖攝取存在異常。還有研究發(fā)現(xiàn)Pgc1α可通過影響B(tài)mal1轉(zhuǎn)錄，參與晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)[39-40]。Pgc1α是否影響B(tài)mal1及其他時(shí)鐘基因節(jié)律表達(dá)，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，異常光周期所致CM 可導(dǎo)致大鼠糖耐量下降，這可能與大鼠腓腸肌Tbc1d1表達(dá)下降以及Bmal1、Per2、Pgc1α的轉(zhuǎn)錄節(jié)律改變有關(guān)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。