賀沁文，鄭 敏，張亦嘉，顧延生

(中國(guó)地質(zhì)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078)

桂竹(Phyllostachysreticulata)為剛竹屬的模式種[1]。剛竹屬(Phyllostachys)隸屬于禾本科(Gramineae)竹亞科(Bambusoideae)，屬下有約60種，為我國(guó)竹林最普遍的栽培種類[2]。該屬研究近年來(lái)進(jìn)展較大，但其屬下關(guān)系有待澄清，與竹亞科其他屬的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議[2]。研究表明，植物的解剖結(jié)構(gòu)是研究植物系統(tǒng)分類的重要依據(jù)[3]，分子生物學(xué)在應(yīng)用于竹亞科系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)也需要形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的補(bǔ)充和驗(yàn)證[4]。有關(guān)剛竹屬植物的報(bào)道顯示該屬葉片的泡狀細(xì)胞、短細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、梭形細(xì)胞、氣孔器、維管束、表皮毛、下表皮乳突等解剖結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征在不同種間存在變化，對(duì)揭示竹亞科植物的系統(tǒng)分類有重要意義[2,5-15]。其中，毛竹(Phyllostachysedulis)和黃槽竹(Phyllostachysaureosulcata)泡狀細(xì)胞、氣孔器、硅細(xì)胞等的形態(tài)，可作為竹類系統(tǒng)分類的依據(jù)[8]；毛竹(Phyllostachysedulis)、剛竹(Phyllostachysviridis)、淡竹(Phyllostachysglauca)之間長(zhǎng)細(xì)胞、短細(xì)胞、氣孔器的形態(tài)特征存在差異[14]；桂竹、毛竹、淡竹之間主脈維管束和梭形細(xì)胞的形態(tài)特征存在差異[15]。目前，剛竹屬下葉片解剖結(jié)構(gòu)被報(bào)道的種有5個(gè)，約占該屬的10%，已有報(bào)道局限于少數(shù)形態(tài)指標(biāo)，尚無(wú)全面的描述，剛竹屬下各物種葉片解剖結(jié)構(gòu)的共同特征為：梭形細(xì)胞不發(fā)達(dá)或無(wú)梭形細(xì)胞[15]，短細(xì)胞單個(gè)或成對(duì)生長(zhǎng)于脈上或脈間，氣孔器集中分布于脈的每側(cè)，乳突成列分布于下表皮長(zhǎng)細(xì)胞表面，微毛分布于脈間，刺毛分布于脈間和脈上，大毛分布于脈上[16]。本研究對(duì)桂竹葉片解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了全面的描述、測(cè)量及分析，建立了橫切面結(jié)構(gòu)與表皮結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系以填補(bǔ)本種葉解剖學(xué)研究的空白，并為桂竹及剛竹屬的系統(tǒng)分類研究提供科學(xué)依據(jù)。此外，桂竹抗性較強(qiáng)，適生范圍大[17]，在我國(guó)黃河流域及其以南地區(qū)廣泛分布，被大量用于建筑、紙張、食用、觀賞等，為一重要經(jīng)濟(jì)種。我國(guó)擁有全世界最大規(guī)模的竹產(chǎn)業(yè)[18]，桂竹為我國(guó)第二大竹材，用途之廣僅次于毛竹[17]，因而擁有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前對(duì)于桂竹的報(bào)道主要集中在基因組研究方面，桂竹的完整葉綠體基因組于2020年被初次報(bào)道[19]，除此以外，對(duì)桂竹葉片的專門(mén)研究有限，尤其是在解剖學(xué)方面。本文對(duì)桂竹葉解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行詳細(xì)描述，可為桂竹資源的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和可持續(xù)開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

桂竹葉片于2020年10月采自中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)未來(lái)城校區(qū)內(nèi)(30°27′31″N，114°36′41″E)。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的桂竹10株，從每株中部的不同枝條取完全舒展、無(wú)病蟲(chóng)害的成熟葉片4片。采摘后剪取葉片中部，立即置于FAA固定液中做固定處理。

主要儀器：Kedee KD-1508型切片機(jī)、烘箱、通風(fēng)櫥、Olympus BX51光學(xué)顯微-拍攝系統(tǒng)。

1.2 樣品制作方法

1.2.1 桂竹葉橫切材料處理方法 取桂竹葉20片，置于25%氫氟酸中脫硅48 h[20]；使用純水漂洗1 d；經(jīng)50%(1.5 h)、70%(1.5 h)、85%(1.5 h)、95%(1.5 h)、100%(0.5 h)叔丁醇梯度脫水及透明化處理；脫水及透明化后的材料浸入體積比為1∶1的石蠟-叔丁醇溶液，置于55 ℃烘箱中處理6 h，再轉(zhuǎn)入體積比為3∶1的石蠟-叔丁醇溶液，置于57 ℃烘箱中處理6 h。烘干后的材料轉(zhuǎn)入100%石蠟溶液，置于59 ℃烘箱中處理12 h，每4 h更換一次石蠟溶液。最后用石蠟包埋、Kedee KD-1508型切片機(jī)切片，切片厚度8～10 μm，中性樹(shù)膠封片，Olympus BX51顯微鏡觀察。

1.2.2 桂竹葉表皮材料處理方法 取桂竹葉20片，葉片上表面朝上置于載玻片上，使用蒸餾水潤(rùn)濕，用刀片輕輕刮去上表皮和葉肉組織，直至取得1 cm2完全透明而不破損的下表皮組織；后翻轉(zhuǎn)葉片，使用同樣方法在葉中部另一位置刮取1 cm2上表皮組織。甘油浸潤(rùn)后使用中性樹(shù)膠封片，Olympus BX51顯微鏡觀察。

1.3 參數(shù)測(cè)量方法

每個(gè)切片和刮片選取5個(gè)視野，在400倍顯微鏡下隨機(jī)觀察維管束、泡狀細(xì)胞、長(zhǎng)細(xì)胞、短細(xì)胞、表皮毛細(xì)胞、氣孔、葉肉細(xì)胞、氣腔、薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞。在所有切片和刮片中，對(duì)每級(jí)維管束各選取10個(gè)進(jìn)行測(cè)量，對(duì)其他每類細(xì)胞各選取50個(gè)進(jìn)行測(cè)量。其中，薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞在主脈和平行脈周圍均有分布。在測(cè)量橫切面高時(shí)，將這2種細(xì)胞近似視作圓形，不再因其分布位置加以區(qū)分。使用SPSS Statistics 26軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片表皮系統(tǒng)

2.1.1 上表皮 桂竹葉片上表皮細(xì)胞沿垂直于葉脈方向呈現(xiàn)“維管束-長(zhǎng)(短)細(xì)胞-泡狀細(xì)胞-長(zhǎng)(短)細(xì)胞-維管束”的交替帶狀結(jié)構(gòu)(圖1A，圖2A)。

在葉片上表面，泡狀細(xì)胞帶分布于2個(gè)長(zhǎng)(短)細(xì)胞帶之間，寬2～3行。泡狀細(xì)胞呈現(xiàn)近圓形，其表面分布有少量矩形的硅質(zhì)凸起(圖1A：bc)。葉片橫切面上，泡狀細(xì)胞成組存在，每2個(gè)維管束之間分布1組(圖1C、1D，圖3)。每組有3個(gè)，中間一個(gè)體積較大，呈現(xiàn)典型的扇形，深入到葉肉內(nèi)部，其兩側(cè)的泡狀細(xì)胞呈現(xiàn)近矩形。

在葉片上表面，長(zhǎng)細(xì)胞帶位于維管束帶的兩側(cè)，寬5～6行(圖1A)。長(zhǎng)細(xì)胞大致呈現(xiàn)矩形，角質(zhì)層向外突起，突起長(zhǎng)度約2 μm(圖1A：lc)。在橫切面上，長(zhǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)近圓形，分布于上表面泡狀細(xì)胞和維管束之間(圖1C、1D，圖2)。短細(xì)胞成對(duì)或單個(gè)分布于2個(gè)長(zhǎng)細(xì)胞之間。當(dāng)成對(duì)出現(xiàn)時(shí)，向葉尖一側(cè)的為硅細(xì)胞(圖1A：sc1)，向葉基一側(cè)的為栓細(xì)胞(圖1A：cc)。硅細(xì)胞呈現(xiàn)邊緣不規(guī)則的近橢圓形，栓細(xì)胞呈現(xiàn)馬鞍形。二者長(zhǎng)寬相近。短細(xì)胞對(duì)數(shù)與長(zhǎng)細(xì)胞個(gè)數(shù)之比約為1∶2。

復(fù)雜鞍形硅細(xì)胞生長(zhǎng)于維管束近軸面和遠(yuǎn)軸面兩側(cè)的表皮上，兩側(cè)表皮上各分布有一行，呈現(xiàn)近矩形或啞鈴形，(圖1A：sc2，圖1B：sc2)。復(fù)雜鞍形硅細(xì)胞廣義上屬于一種短細(xì)胞，本研究另列出以作區(qū)分。上表皮復(fù)雜鞍形硅細(xì)胞排列較為稀疏，每2個(gè)之間距離約10 μm。

桂竹葉的氣孔器為橫列型氣孔器，在葉片上表皮分布稀疏，每個(gè)400倍視野(面積約84 800 μm2，下文亦同)下可見(jiàn)0～6個(gè)。氣孔夾于2個(gè)長(zhǎng)細(xì)胞之間生長(zhǎng)，其長(zhǎng)軸方向與長(zhǎng)細(xì)胞相同。保衛(wèi)細(xì)胞較為細(xì)小，形態(tài)特征不易觀察。副衛(wèi)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的圓頂型(圖2A)。

2.1.2 下表皮 由于不存在泡狀細(xì)胞，下表皮呈現(xiàn)“維管束-長(zhǎng)(短)細(xì)胞-維管束”的交替帶狀結(jié)構(gòu)。與上表皮相比，下表皮細(xì)胞小而密集，表皮毛發(fā)達(dá)(圖1B，圖2C)。

在葉片下表面，長(zhǎng)細(xì)胞分布于2個(gè)維管束之間，寬10～12行，長(zhǎng)度波動(dòng)較大。其角質(zhì)層突起較上表皮長(zhǎng)細(xì)胞更為明顯，突起長(zhǎng)度約3 μm(圖1B：lc)。下表皮長(zhǎng)細(xì)胞在遠(yuǎn)軸面一側(cè)生長(zhǎng)有5～6個(gè)乳突(圖1C、1D：pp)。下表皮短細(xì)胞分布方式與上表皮相同，大小相近(圖1B：sc1、cc)。下表皮短細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)少于上表皮，短細(xì)胞對(duì)數(shù)與長(zhǎng)細(xì)胞個(gè)數(shù)之比約為1∶10。

下表皮復(fù)雜鞍形細(xì)胞分布規(guī)律與上表皮基本相同(圖1B：sc2)，呈現(xiàn)啞鈴形，大小與上表皮相接近。

桂竹下表皮細(xì)胞乳突發(fā)育密集，分布于長(zhǎng)細(xì)胞表面，在下表皮呈現(xiàn)平行于維管的線形分布，排布較為規(guī)律(圖1B：pp)。每2個(gè)乳突間距約3 μm，每個(gè)長(zhǎng)細(xì)胞根據(jù)其大小生長(zhǎng)有2～8個(gè)乳突。桂竹下表皮毛有大毛、刺毛2種。大毛密集分布于葉片下表面的脈上，每個(gè)400倍視野下可見(jiàn)約25個(gè)，長(zhǎng)度變化幅度大(圖1B：ma)。相較于分布在其他部位的大毛，分布在維管束附近的大毛更加粗壯(圖1B：ma)。每根大毛的朝向一致，從葉基指向葉尖方向(圖1E)。刺毛在下表面稀疏分布于脈間和脈上，每個(gè)400倍視野下可見(jiàn)3～5個(gè)(圖1B：mi)。

下表皮氣孔器分布方式與上表皮相近，數(shù)量遠(yuǎn)多于上表皮，400倍鏡視野下可見(jiàn)約50個(gè)(圖1B)。大小與上表皮接近。

2.2 葉片基本組織系統(tǒng)

2.2.1 葉肉細(xì)胞 桂竹葉肉細(xì)胞層數(shù)隨部位變化。上表皮長(zhǎng)細(xì)胞下方、氣腔上方的葉肉最厚，約3～4層；泡狀細(xì)胞下方的葉肉最薄，約2～3層(圖2B)。靠近上表皮的第1層葉肉細(xì)胞排列最為規(guī)則，呈現(xiàn)略微彎曲的指狀，第2～4層葉肉細(xì)胞排布較為不規(guī)則，呈現(xiàn)近放射狀(圖1D)。

2.2.2 梭形細(xì)胞 梭形細(xì)胞位于每個(gè)維管束兩側(cè)，無(wú)色透明，形態(tài)近于矩形(圖1D)。

2.3 葉片維管組織系統(tǒng)

桂竹主脈位于葉片中央位置，其兩側(cè)各有6～7條一級(jí)平行脈，每2條一級(jí)平行脈之間有6～8條二級(jí)平行脈(圖2)。桂竹的主脈和1級(jí)平行脈維管束具“V”字形結(jié)構(gòu)。各級(jí)維管束鞘由一層較大的薄壁細(xì)胞和一層較小的厚壁細(xì)胞構(gòu)成。維管束周圍無(wú)“花環(huán)形”結(jié)構(gòu)特征出現(xiàn)，為C3植物(圖3)。

2.3.1 主脈 主脈在所有葉脈中最為發(fā)育，結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，木質(zhì)部和韌皮部最為分化。主脈與多個(gè)小型維管束形成復(fù)合維管系統(tǒng)，體積較大，橫截面寬度約200 μm(圖3：mv)。中央的一個(gè)維管束形態(tài)與一級(jí)平行脈近似，近軸面和遠(yuǎn)軸面處均有發(fā)達(dá)的機(jī)械組織與表皮相連，其余的小維管束鞘狀結(jié)構(gòu)不完整，薄壁細(xì)胞和厚壁細(xì)胞排列不規(guī)則。主脈兩側(cè)的梭形細(xì)胞最為發(fā)達(dá)，所形成的氣腔結(jié)構(gòu)體積最大。

2.3.2 一級(jí)平行脈 一級(jí)平行脈寬46.5～77.3 μm，木質(zhì)部與韌皮部分化明顯，維管束被薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞包圍(圖1C)。木質(zhì)部發(fā)育有3個(gè)大型導(dǎo)管，近軸面一側(cè)較小的導(dǎo)管為原生導(dǎo)管，遠(yuǎn)軸面一側(cè)2個(gè)大小、形態(tài)相近的導(dǎo)管為后生導(dǎo)管，三者呈現(xiàn)“V”字形排列。近軸面一側(cè)有少量機(jī)械組織與表皮相連(圖3：1st pv)。

2.3.3 二級(jí)平行脈 二級(jí)平行脈寬27.7～31.4 μm，木質(zhì)部與韌皮部分化不明顯，木質(zhì)部不發(fā)育大型導(dǎo)管(圖1D)。維管束鞘細(xì)胞中，外側(cè)的薄壁細(xì)胞較為發(fā)達(dá)，排列整齊，內(nèi)側(cè)的厚壁細(xì)胞數(shù)量較少。近軸面一側(cè)有少量機(jī)械組織與表皮連接(圖3：2nd pv)。

2.4 葉片解剖結(jié)構(gòu)變異分析

對(duì)桂竹葉片的形態(tài)指標(biāo)做統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1～3。各個(gè)形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)差別較大，范圍為4.9%～37.8%。其中，上表皮氣孔、上表皮復(fù)雜鞍形細(xì)胞、二級(jí)平行脈的形態(tài)最為穩(wěn)定，各項(xiàng)指標(biāo)的變異系數(shù)均小于10%；下表皮長(zhǎng)細(xì)胞、葉肉細(xì)胞的指標(biāo)波動(dòng)幅度最大，變異系數(shù)可達(dá)25%以上。通過(guò)對(duì)上、下表皮形態(tài)指標(biāo)的對(duì)比得出，下表皮細(xì)胞的形態(tài)指標(biāo)變異系數(shù)普遍大于上表皮細(xì)胞，說(shuō)明桂竹葉片上表皮細(xì)胞形態(tài)較為穩(wěn)定。

表1 桂竹上表皮形態(tài)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)Table 1 Morphological indices upper epidermis of P.reticulata

表2 桂竹下表皮形態(tài)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)Table 2 Morphological indices of lower epidermis of P.reticulata

表3 桂竹葉肉及葉脈形態(tài)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)Table 3 Morphological indices of veins and mesophyll of P.reticulata

3 結(jié)論與討論

桂竹是剛竹屬的模式種，研究桂竹葉片的解剖結(jié)構(gòu)，可以為研究其他剛竹屬植物的系統(tǒng)分類和演化趨勢(shì)提供參考。

桂竹葉片表面，長(zhǎng)細(xì)胞間的短細(xì)胞多數(shù)以馬鞍形栓細(xì)胞和橢圓形硅細(xì)胞成對(duì)的形式生長(zhǎng)。國(guó)產(chǎn)17屬33種竹材中，僅有剛竹屬葉片同時(shí)存在橢圓形硅細(xì)胞與馬鞍形栓細(xì)胞，為剛竹屬的一個(gè)明顯特征[14]。因此，上表皮馬鞍形栓細(xì)胞和橢圓形硅細(xì)胞的成對(duì)出現(xiàn)可作為識(shí)別剛竹屬的依據(jù)。對(duì)于生長(zhǎng)于維管束兩側(cè)的短細(xì)胞，即復(fù)雜鞍形硅細(xì)胞，早期學(xué)者指出，其分布和形態(tài)是辨別竹亞科植物的重要特征[21]。禾本科各亞科植物泡狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)參數(shù)的概率分布函數(shù)顯示，各亞科之間泡狀細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)存在顯著性差異，因此泡狀細(xì)胞的形態(tài)可作為分辨禾本科不同亞科植物的參考依據(jù)[6]。桂竹葉片表皮泡狀植硅體的橫向長(zhǎng)度、縱向長(zhǎng)度等形態(tài)學(xué)參數(shù)對(duì)于禾本科植物的分類定種有一定參考價(jià)值[22]。與竹亞科其他種的葉細(xì)胞相比，桂竹的梭形細(xì)胞窄而薄，葉肉細(xì)胞的分化水平較高(趙惠如等[8]認(rèn)為，葉細(xì)胞的分化程度與梭形細(xì)胞的寬度、厚度呈負(fù)相關(guān)性。丁雨龍等[15]認(rèn)為，桂竹葉片無(wú)梭形細(xì)胞，這與本研究的觀察結(jié)果相矛盾。桂竹氣孔的副衛(wèi)細(xì)胞類型為圓頂型，這與桂竹的生境有關(guān)系。圓頂型副衛(wèi)細(xì)胞是禾本科植物副衛(wèi)細(xì)胞中較為進(jìn)化的一類型，常于偏干、寒的溫帶環(huán)境中出現(xiàn)[23]。而圓頂型副衛(wèi)細(xì)胞如何提高桂竹對(duì)偏干、寒環(huán)境的適應(yīng)性，則有待進(jìn)一步研究。桂竹的下表皮乳突呈現(xiàn)平行于維管的線形分布，這一分布方式有較強(qiáng)的規(guī)律性，為木本竹所特有[9]，且在禾本科中為演化水平較高的物種所有[16,23]。近年，對(duì)于竹亞科筇竹屬筇竹(Qiongzhueatumidinoda)[24]、慈竹屬慈竹(Neosinocalamusaffinis)[25]葉解剖結(jié)構(gòu)的全面描述亦被報(bào)道，將筇竹、慈竹、桂竹葉解剖結(jié)構(gòu)做對(duì)比，得出桂竹葉表皮長(zhǎng)細(xì)胞較筇竹、慈竹更發(fā)達(dá)；薄壁細(xì)胞、厚壁細(xì)胞較筇竹、慈竹不發(fā)達(dá)；泡狀細(xì)胞大小與筇竹相近，較慈竹不發(fā)達(dá)；梭形細(xì)胞較筇竹不發(fā)達(dá)[24-25]。

綜上所述，依照已有的研究結(jié)論，桂竹窄而薄的梭形細(xì)胞、分化水平較高的葉肉細(xì)胞、圓頂型的氣孔副衛(wèi)細(xì)胞、線形排布的下表皮乳突等特征均屬于演化上比較進(jìn)化的類型[8,16,23]。本文重點(diǎn)描述了桂竹葉片的表皮及橫切面解剖結(jié)構(gòu)，可用于桂竹的鑒定，為竹亞科的系統(tǒng)分類學(xué)研究提供資料。需要注意的是，本研究并未在不同竹種間做具體的解剖結(jié)構(gòu)比較。將本研究結(jié)論應(yīng)用于竹亞科的系統(tǒng)分類學(xué)時(shí)，有必要將桂竹葉解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果、各個(gè)結(jié)構(gòu)的變異分析結(jié)果與其他竹種進(jìn)行比較研究[15]。