陸文燁 宋夢(mèng)星 吳芬 夏敏 馬占龍

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，江蘇 南京 210029)

心力衰竭是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題，全世界心力衰竭的患病率較高。盡管治療策略取得了重大進(jìn)展，但心力衰竭的發(fā)病率和死亡率仍很高[1]。心肌纖維化的特征是心肌中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過多沉積，是幾乎所有形式心力衰竭的必要組成部分[2-3]。因此，檢測(cè)心肌纖維化的發(fā)生，對(duì)及早發(fā)現(xiàn)和治療心力衰竭起著重要作用[4-6]。心臟磁共振成像作為一種無創(chuàng)評(píng)估心肌纖維化的強(qiáng)大工具[7]，檢測(cè)磁共振T2加權(quán)成像(T2 weighted imaging，T2WI)低信號(hào)則反映心肌梗死后局部心肌組織的纖維化改變。肌腱蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)最大的基底膜糖蛋白家族，肌腱蛋白X(tenascin-X，TNX)是其中表達(dá)量最高且促進(jìn)心肌纖維化的主要結(jié)構(gòu)蛋白[8-9]，促進(jìn)表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)基底膜細(xì)胞之間的黏附性。TNX的高表達(dá)加快了表皮樣細(xì)胞向纖維化細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了心肌的纖維化，進(jìn)而影響了心肌細(xì)胞的血液再灌注及心肌修復(fù)[8，10-12]。動(dòng)態(tài)檢測(cè)心肌纖維化細(xì)胞中TNX的表達(dá)，對(duì)于準(zhǔn)確地評(píng)估心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)心血管疾病的防治水平，具有重要的臨床價(jià)值，是研究心肌纖維化變化的理想特異性靶點(diǎn)。

本研究通過合成anti-TNX-USPIO探針，利用7.0 T磁共振檢測(cè)TNX在大鼠心肌纖維化細(xì)胞中的表達(dá)，目的是評(píng)估探針靶向檢測(cè)TNX表達(dá)的可行性，探索TNX作為檢測(cè)靶點(diǎn)是否可行，促進(jìn)心肌纖維化的在體評(píng)估和診治水平。

1 材料與方法

1.1 心肌纖維化大鼠模型建立

選取36只6周齡無特定病原雄性SD大鼠，體重(225±10)g(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，分為空白對(duì)照組(n=12)、單純對(duì)照組(n=12)和實(shí)驗(yàn)組(n=12)。單純對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均皮下注射異丙腎上腺素，每日劑量為5 mg/kg，連續(xù)注射7 d；空白對(duì)照組皮下注射同等劑量生理鹽水，連續(xù)注射7 d。大鼠均飼養(yǎng)于無特定病原屏障內(nèi)，3只/籠，正常飲食飲水，環(huán)境溫度維持于20～22 ℃，相對(duì)濕度為55%～60%。

1.2 anti-TNX-USPIO探針合成及表征分析

選用乙酰丙酮鐵作為前驅(qū)反應(yīng)物，溶劑選用二芐醚，選用500 mL三頸燒瓶，依次加入20 mmoL乙酰丙酮鐵、100 mL二芐醚和23 mL油酸，調(diào)節(jié)氮?dú)馑俾蕿?130 mL/min，在冷凝回流條件下進(jìn)行升溫，以此合成10 nm級(jí)Fe3O4@OA納米顆粒。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法，在Fe3O4@OA納米顆粒表面修飾DSPE-PEG2000-COOH，制得Fe3O4@OA@PEG納米顆粒水溶液。于4 mL三氯甲烷中加入150 mg DSPE-mPEG2000和50 mg DSPE-PEG2000-COOH，充分溶解后加入鐵含量為10 mg的Fe3O4@OA納米顆粒，用100 Hz超聲充分混合，膠乳去離子水后蒸發(fā)10 min獲得穩(wěn)定的Fe3O4@OA@PEG納米顆粒水溶液。采用一步法偶聯(lián)抗體制備合成探針，取1 mg Fe3O4@OA@PEG(以Fe計(jì))溶液，加入200 μL多克隆TNX抗體(購自南京凱默爾生物科技中心)，加入100 μL維持電解質(zhì)溶液(0.01 M，pH=5.5)調(diào)節(jié)溶液pH至5，加入1.0 mg二氯乙烷進(jìn)行交聯(lián)，置于搖床混勻吸附30 min(120 r/min)。反應(yīng)結(jié)束后用磁分離柱純化游離抗體，純化后的anti-TNX-USPIO靶向探針再次懸浮于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)中，4 ℃冰箱保存。

采用透射電子顯微鏡測(cè)定探針粒徑，動(dòng)態(tài)光散射分析儀測(cè)定探針?biāo)土郊癦eta電位。在7.0 T磁共振下用不同鐵濃度測(cè)定T2弛豫率。

1.3 磁共振圖像采集及分析

實(shí)驗(yàn)組(n=12)注入anti-TNX-USPIO合成探針(劑量為10 mg Fe/kg)，空白對(duì)照組(n=12)和單純對(duì)照組(n=12)分別注入同等劑量單純超微超順磁性氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)，均采用尾靜脈注射。三組大鼠分別于打藥前及打藥10 h后行磁共振成像，比較前后心肌信號(hào)強(qiáng)度變化。

心臟磁共振采用7.0 T磁共振掃描儀(Bruker PharmaScans，Germany，南京醫(yī)科大學(xué)磁共振影像實(shí)驗(yàn)室)，大鼠線圈，接心電呼吸門控，通過氣體麻藥量調(diào)節(jié)心率約300次/min，呼吸頻率維持約35次/min。主要參數(shù)：視角3 cm×3 cm，矩陣256×256，回波時(shí)間 3.5 ms，重復(fù)時(shí)間130 ms，掃描層厚1 mm，翻轉(zhuǎn)角30 °。

圖像掃描完成后，采用Image J軟件計(jì)算心肌細(xì)胞的磁共振成像信號(hào)強(qiáng)度，在T2WI序列上每個(gè)標(biāo)本畫3個(gè)感興趣區(qū)，取其平均值。相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度(relative signal intensity，rSI)定義為同層面心肌信號(hào)強(qiáng)度/肌肉信號(hào)強(qiáng)度。

1.4 病理學(xué)檢查

掃描完成后，采用10%水合氯醛過量麻醉處死大鼠(劑量5 mL/kg)，開胸取大鼠心臟標(biāo)本，用生理鹽水及PBS反復(fù)沖洗，固定于4%多聚甲醛。常規(guī)浸蠟包埋進(jìn)行冰凍切片，片厚4 μm。光學(xué)顯微鏡下觀察心臟組織結(jié)構(gòu)變化。標(biāo)本分別作蘇木精-伊紅染色、Masson染色和普魯士藍(lán)染色，蘇木精-伊紅染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，Masson染色觀察心肌細(xì)胞纖維化情況，普魯士藍(lán)染色觀察心肌細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒沉積情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 anti-TNX-USPIO合成探針的表征分析

靶向TNX抗體的合成探針溶液呈棕色清澈液體，透射電子顯微鏡下顯示探針呈類球形，于PBS中穩(wěn)定分布，未見明顯團(tuán)聚物形成(圖1a)。單純USPIO的水合粒徑為(15.55±0.45)nm，合成探針的水合粒徑為(22.89±1.66)nm，二者比較有顯著性差異(P=0.002)，表明TNX抗體與USPIO納米顆粒成功連接。將不同時(shí)間點(diǎn)的探針?biāo)蛣?dòng)力尺寸分布繪制成圖(圖1c)，說明合成探針顆粒分散性較好，無明顯聚集，保證探針在儲(chǔ)存過程中不會(huì)發(fā)生明顯變化。合成前單純USPIO的Zeta電位為-(46.2±1.38)mV，合成后TNX 抗體探針的Zeta電位為-(22.27±3.61)mV，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，再次證明TNX抗體已成功連接USPIO納米顆粒。ELISA結(jié)果顯示TNX合成探針保持較高的生物活性，而單純USPIO幾乎無活性(圖1b)。磁共振檢測(cè)合成探針的T2弛豫效能為193.2 mM-1s-1(圖1d和圖1e)，表明合成探針具有良好的超順磁性。

注：圖a為合成探針在PBS中均勻分布，圖b為ELISA法檢測(cè)OD450值，圖c為不同時(shí)間點(diǎn)合成探針的水和動(dòng)力尺寸分布圖，圖d和圖e為不同鐵濃度下檢測(cè)T2弛豫效能。

2.2 TNX探針靶向心肌纖維化大鼠心臟磁共振成像及信號(hào)分析

三組大鼠分別通過尾靜脈注入anti-TNX-USPIO(實(shí)驗(yàn)組)及單純 USPIO(單純對(duì)照組和空白對(duì)照組)，應(yīng)用7.0 T磁共振進(jìn)行前后兩次活體成像掃描。探針注入前，空白對(duì)照組未見明顯心肌異常改變(圖2a)，實(shí)驗(yàn)組及單純對(duì)照組均顯示為T2WI信號(hào)減低(圖2c和圖2e)，實(shí)驗(yàn)組及單純對(duì)照組左心室壁厚度[(1.26±0.14)mm]與空白對(duì)照組左心室壁厚度[(2.73±0.23)mm]相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明心室壁變薄?？瞻讓?duì)照組rSI為2.33±0.59，與實(shí)驗(yàn)組及單純對(duì)照組的rSI(1.25±0.11)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明實(shí)驗(yàn)組與單純對(duì)照組心室壁纖維化改變，與既往研究相符，建模成功。

與注入前比較，注入anti-TNX-USPIO 及單純USPIO后10 h，實(shí)驗(yàn)組可見心肌信號(hào)強(qiáng)度減低(圖2f)，實(shí)驗(yàn)組打藥后rSI為1.06±0.12，與打藥前的rSI(1.21±0.11)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；單純對(duì)照組心肌信號(hào)強(qiáng)度未見明顯減低，打藥后rSI為1.30±0.15，與打藥前的rSI(1.29±0.11)比較無顯著差異性(P=0.783)；空白對(duì)照組心肌信號(hào)強(qiáng)度未見明顯減低(圖2b)，打藥后rSI為2.17±0.28，與打藥前的rSI(2.33±0.59)比較無顯著差異性(P=0.240)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組打藥前后心肌信號(hào)強(qiáng)度明顯減低，表明合成探針anti-TNX-USPIO對(duì)T2WI信號(hào)有明顯減低作用。

2.3 病理學(xué)檢查結(jié)果

Masson染色顯示單純對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞間纖維組織大量增生(圖3A-b和圖3A-c)，表明心肌纖維化改變，已成功建立心肌纖維化模型。普魯士藍(lán)染色證實(shí)空白對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)無明顯鐵顆粒沉積(圖3C-a)，單純對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)少許鐵顆粒沉積(圖3C-b)，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)見明顯鐵顆粒沉積(圖3C-c)，驗(yàn)證了纖維化心肌細(xì)胞中TNX抗體探針的存在。

3 討論

心肌纖維化是纖維結(jié)締組織對(duì)心臟侵害的結(jié)果，是指心肌組織中膠原纖維過量沉積、各型膠原比例失調(diào)、膠原纖維排列紊亂以及最終導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)重構(gòu)(包括心腔擴(kuò)大、室壁變薄和心肌細(xì)胞肥大及凋亡)。在刺激的作用下，血液循環(huán)的增加以及心肌促纖維化生長因子和細(xì)胞因子水平的升高，均可引發(fā)纖維化反應(yīng)。心肌纖維化形成機(jī)制較復(fù)雜，心肌纖維化發(fā)生在多種促纖維化因子起作用時(shí)，存在于心臟的多種細(xì)胞類型，促纖維化因子可作為心肌細(xì)胞喪失(即修復(fù)性纖維化)反應(yīng)的一部分被激活，也可通過機(jī)械和非機(jī)械(如神經(jīng)激素、炎癥或代謝)對(duì)心臟的應(yīng)激(即反應(yīng)性纖維化)被激活[13]。在效應(yīng)期，這種促纖維化生長因子和細(xì)胞因子與它的受體結(jié)合，然后觸發(fā)信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的激活，在這些激活刺激的響應(yīng)下，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的高表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。心肌纖維化的特征是過量的膠原纖維沉積。膠原纖維沉積可表現(xiàn)為微瘢痕或位于單個(gè)心肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞束周圍或心肌內(nèi)血管周圍的間質(zhì)間隙內(nèi)的大束膠原沉積[14]。使用心臟磁共振或CT測(cè)量心肌細(xì)胞外體積可檢測(cè)彌漫性心肌纖維化，心肌細(xì)胞外體積能反映膠原纖維沉積的數(shù)量。晚期增強(qiáng)心臟磁共振可提供高分辨率的心肌組織表征，識(shí)別局部心肌的纖維化瘢痕，間接成為評(píng)估纖維化病變的技術(shù)[15]。但這些技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌纖維化的精準(zhǔn)檢測(cè)與評(píng)估。

注：空白對(duì)照組(圖a和圖b)與單純對(duì)照組(圖c和圖d)注入單純 USPIO以及實(shí)驗(yàn)組(圖e和圖f)注入anti-TNX-USPIO前后對(duì)比圖像，實(shí)驗(yàn)組及單純對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，左心室壁厚度變薄，心肌信號(hào)減低(紅色箭頭所示)；與注入前比較，實(shí)驗(yàn)組心肌信號(hào)強(qiáng)度減低，肝實(shí)質(zhì)信號(hào)減低(*所示)，空白對(duì)照組與單純對(duì)照組無明顯改變。

TNX是肌腱蛋白家族中表達(dá)量最高的蛋白，它不僅是一種結(jié)構(gòu)蛋白，還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附來顯示基質(zhì)細(xì)胞蛋白的特性，其穩(wěn)定性表達(dá)與細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)，其高表達(dá)與血管壁纖維化及鈣化相關(guān)[7，16-17]。TNX也是信號(hào)通路的細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子。事實(shí)上，TNX已被證明可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β的生物利用度和調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的可塑性。TNX的組織分布與肌腱蛋白C的分布往往是相互的，TNX主要參與皮膚組織穩(wěn)態(tài)：限制角化細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，而肌腱蛋白C發(fā)揮相反的作用：促進(jìn)細(xì)胞分裂和運(yùn)動(dòng)[17]。USPIO的靶向成像對(duì)炎癥作用很有效，因?yàn)樗苯幼饔糜诰奘杉?xì)胞[18-20]。利用納米氧化鐵增強(qiáng)磁共振成像，可利用超短回波時(shí)間來提高磁共振信號(hào)的線性度；高分辨率成像可以結(jié)合使用，以提高炎癥量化的空間分辨率和敏感性。USPIO可定位炎癥細(xì)胞浸潤的區(qū)域[21-23]。磁共振靶向檢測(cè)USPIO標(biāo)記的巨噬細(xì)胞的可行性已在小鼠心肌梗死研究中得到證實(shí)[24]。USPIO具有獨(dú)特的造影劑特性，可用于靶向心血管成像。USPIO定位于活躍的巨噬細(xì)胞浸潤區(qū)域，并在T2WI上顯示為低信號(hào)[25-26]。TNX的高表達(dá)加快了表皮樣細(xì)胞向纖維化細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了心肌的纖維化，進(jìn)而影響了心肌細(xì)胞的血流再灌注及心肌修復(fù)。動(dòng)態(tài)檢測(cè)心肌纖維化細(xì)胞中TNX的表達(dá)，對(duì)于準(zhǔn)確地評(píng)估心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展，促進(jìn)心血管疾病的防治，具有重要的臨床價(jià)值，是研究心肌纖維化的理想特異性靶點(diǎn)。

注：圖A為Masson染色(×400)，空白對(duì)照組未見明顯纖維化病變(圖A-a)，單純對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組膠原纖維大量增生(圖A-b和圖A-c)。圖B為蘇木精-伊紅染色(×400)，空白對(duì)照組肌肉細(xì)胞形態(tài)完整，界限分明(圖B-a)；單純對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組肌肉細(xì)胞漿呈現(xiàn)明顯嗜伊紅性，橫紋消失，組織中有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(圖B-b和圖B-c)。圖C為普魯士藍(lán)染色(×400)，空白對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)未見明顯鐵顆粒沉積(圖C-a)，單純對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)見少許鐵顆粒沉積(圖C-b細(xì)箭頭所示)，實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞內(nèi)見明顯鐵顆粒沉積(圖C-c細(xì)箭頭所示)。

本實(shí)驗(yàn)在注入探針前后分別掃描，注入探針前，空白對(duì)照組未見明顯心肌異常，實(shí)驗(yàn)組和單純對(duì)照組均顯示T2WI信號(hào)減低，心室壁變薄，空白對(duì)照組的rSI(2.33±0.59)與實(shí)驗(yàn)組和單純對(duì)照組的rSI(1.25±0.11)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，表明實(shí)驗(yàn)組與單純對(duì)照組心室壁纖維化改變，建模成功，符合既往研究結(jié)果。探針注入后，實(shí)驗(yàn)組可見心肌信號(hào)強(qiáng)度減低，實(shí)驗(yàn)組打藥后rSI為1.06±0.12，與打藥前的rSI(1.21±0.11)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；單純對(duì)照組及空白對(duì)照組心肌信號(hào)強(qiáng)度未見明顯減低。普魯士藍(lán)染色證實(shí)實(shí)驗(yàn)組斑塊內(nèi)可見明顯鐵顆粒沉積，單純對(duì)照組僅可見少許鐵顆粒沉積。大鼠體內(nèi)磁共振成像結(jié)果及病理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，anti-TNX-USPIO合成探針可作為特異性靶向TNX的分子成像載體，無創(chuàng)和在體檢測(cè)纖維化心肌內(nèi)TNX蛋白的分布，可將TNX作為心肌纖維化治療的特異性靶點(diǎn)，為下一步評(píng)估及診療提供思路。

本次實(shí)驗(yàn)存在一定局限性，選用10 nm級(jí)USPIO合成探針?biāo)璩练e時(shí)間得到縮短，但影響探針到達(dá)靶向部位的數(shù)量，普魯士藍(lán)染色圖像中顯示鐵顆粒沉積數(shù)量較少，下一步需改進(jìn)探針合成，優(yōu)化anti-TNX-USPIO探針靶向成像。

總之，纖維化心肌細(xì)胞中存在TNX的表達(dá)，anti-TNX-USPIO合成探針可實(shí)現(xiàn)大鼠心肌纖維化細(xì)胞中TNX內(nèi)靶向成像的檢測(cè)目的，也提示TNX有望作為心肌纖維化治療的特異性靶點(diǎn)，為下一步臨床防治心肌纖維化的研究提供新思路。