王軍玉 邵路軍

1 河南省長(zhǎng)垣市中醫(yī)醫(yī)院耳鼻喉科 453400； 2 鄭州博愛(ài)眼耳鼻喉醫(yī)院麻醉科

喉鱗狀細(xì)胞癌為耳鼻喉外科高發(fā)惡性腫瘤，近年來(lái)喉癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。隨著手術(shù)方式不斷改進(jìn)與放化療等方式輔助治療，喉鱗狀細(xì)胞癌治療確定一定進(jìn)展，但患者預(yù)后仍不佳，特別是晚期患者預(yù)后較差。故深入了解喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制，通過(guò)篩選腫瘤相關(guān)特異性標(biāo)志物可為早期診斷發(fā)現(xiàn)腫瘤并治療提供參考依據(jù)，為目前臨床亟需解決的難題[1-2]。 微小RNA為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的非編碼短序列的小RNA，長(zhǎng)度在18～25個(gè)核苷酸，成熟miR與靶基因mRNA完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，降解或沉默靶基因，具有類似癌基因和抑癌基因作用。miR分子為早期癌癥檢測(cè)的標(biāo)記分子，能早期診斷預(yù)測(cè)腫瘤疾病發(fā)生，對(duì)診斷喉鱗狀細(xì)胞癌并判斷患者預(yù)后具有重要價(jià)值[3]。microRNA為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)編碼蛋白基因表達(dá)內(nèi)源性非編碼RNA分子，研究顯示[4]，miR-33b與miR-3195在惡性腫瘤中異常表達(dá)。為此，本研究通過(guò)對(duì)68例喉鱗狀細(xì)胞癌患者癌組織與癌旁組織的miR-33b、miR-3195表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，并經(jīng)相關(guān)性分析miR分子表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系，旨在為判斷患者預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，回顧性分析選取長(zhǎng)垣市中醫(yī)醫(yī)院2018年10月—2020年10月收治的68例喉鱗狀細(xì)胞癌患者，手術(shù)取喉鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)辰化療中國(guó)專家共識(shí)》標(biāo)準(zhǔn)[5]，且手術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為喉鱗狀細(xì)胞癌；術(shù)前無(wú)放化療等抗腫瘤治療；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤患者；肝腎等臟器衰竭患者；免疫系統(tǒng)疾病患者；傳染性疾病患者；精神疾病及意識(shí)障礙患者；凝血功能障礙患者。納入患者中男58例，女10例；年齡48～72歲，平均年齡(68.48±7.29)歲；組織分化程度：低分化21例、中分化28例、高分化19例；臨床TNM分期：T1期16例、T2期20例、T3期23例、T4期9例；腫瘤類型：聲門型37例、聲門上型17例、聲門下型14例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移29例、無(wú)轉(zhuǎn)移39例。

1.2 方法 (1)RNA提?。孩偃『眵[狀細(xì)胞癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁正常組織，于液氮下研成粉末，刮入EP管中；②管內(nèi)分別加入裂解液充分混勻，于室溫下靜置；③管內(nèi)加入氯仿，EP管上下顛倒數(shù)次，當(dāng)其溶液變?yōu)槿榘咨?，靜置10min；④使用離心機(jī)進(jìn)行離心，靜置，EP管內(nèi)分成3層，上層液相中含有RNA；⑤將上清液移到新的EP管內(nèi)，加入異丙醇，于低溫下沉淀，后離心5min；⑥加入預(yù)冷乙醇，上下顛倒后離心；⑦棄除上清液干燥的RNA沉淀，加入DEPC水混勻，于室溫下溶解。采用分光光度儀(上海儀電分析儀器有限公司，型號(hào)：N2S/N2)檢測(cè)RNA的純度，良好RNA的OD260/OD280位于1.8～2.0，該數(shù)值表明RNA純度合格。(2)逆轉(zhuǎn)錄：①于PCR管內(nèi)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；②配置PCR體系，振蕩混勻后離心，在低溫冰盒上操作，管內(nèi)先后加入DNA模板與引物，加入MIX體系，待無(wú)氣泡產(chǎn)生后將PCR管放入PCR儀器中，逆轉(zhuǎn)錄體系中于37℃中保溫使其完全反應(yīng)后放置85℃中終止反應(yīng);③向體系中加入ddH2O進(jìn)行稀釋，放置冰箱內(nèi)保存待用。(3)PCR檢測(cè)：①配置反應(yīng)體系；②配置PCR反應(yīng)條件：95℃進(jìn)行15min預(yù)變，進(jìn)入循環(huán)后，于94℃變性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，對(duì)熒光進(jìn)行采集，共40循環(huán)；于60～95℃下融解，內(nèi)參設(shè)為U6，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，采用2-ΔΔCT，ΔΔCT=(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因)研究組-(Ct目標(biāo)基因-Ct管家基因)對(duì)照組，計(jì)算相對(duì)定量法檢測(cè)miR-33b、miR-3195表達(dá)量[6-7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料分析采用t檢驗(yàn)和方差分析，相關(guān)性的分析采用Spearman秩相關(guān)方法；以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-33b、miR-3195表達(dá)水平比較 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-33b、miR-3195表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組織 miR-33b、miR-3195表達(dá)水平比較

2.2 癌組織 miR-33b、miR-3195表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-33b、miR-3195表達(dá)量與性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)，與組織分化程度、TNM分期、腫瘤部位及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 癌組織 miR-33b、miR-3195表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.3 癌組織miR-33b、miR-3195表達(dá)與病理特征相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，喉鱗狀細(xì)胞癌患者miR-33b、miR-3195表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 癌組織 miR-33b、miR-3195表達(dá)與病理特征相關(guān)性分析

3 討論

喉鱗狀細(xì)胞癌為頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占有一定比率。該腫瘤分為聲門型、聲門上型與下型三種類型，其中聲門型最常見(jiàn)，男性發(fā)病率高于女性。近年來(lái)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率逐漸上升，認(rèn)為該腫瘤的發(fā)生發(fā)展為多因素多步驟綜合作用結(jié)果，但具體發(fā)病原因尚不明確。目前臨床治療喉鱗狀細(xì)胞癌的方式有手術(shù)、放化療、基因等治療，患者在早期能通過(guò)多種方式進(jìn)行治愈，對(duì)于晚期患者的療效較差[8-9]。故探討有效檢測(cè)指標(biāo)及預(yù)后指標(biāo)以制定合理高效的治療方法對(duì)提高患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)生存時(shí)間極為重要。

微小RNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA表達(dá)，但無(wú)蛋白質(zhì)編碼功能，長(zhǎng)度在19～25個(gè)核苷酸，為一類單鏈小分子RNA，可經(jīng)多種途徑影響生物體生命過(guò)程。與多種長(zhǎng)鏈非編碼RNA相比，miRNA在人類基因組中占比較低，但部分基因可通過(guò)與miRNA結(jié)合而受其調(diào)控。研究顯示，大多數(shù)miRNA位于染色體腫瘤相關(guān)部位[10-11]。隨著近年來(lái)對(duì)惡性腫瘤發(fā)病相關(guān)機(jī)制不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在喉鱗狀細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，說(shuō)明了miRNA可能促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)展，與其發(fā)生發(fā)展具有一定關(guān)系。miR-33b為miR-33家族成員，能調(diào)節(jié)膽固醇穩(wěn)態(tài)及脂質(zhì)、糖類代謝功能。有研究指出[12]，miR-33b能抑制乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞特性、轉(zhuǎn)移與侵襲，發(fā)揮抑癌作用。在喉鱗狀細(xì)胞癌中miR-33a能通過(guò)直接靶向PIM-1原癌基因3’端非翻譯區(qū)發(fā)揮抗增殖功能，在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，為抑癌基因。miR-3195位于20號(hào)染色體的q13.33上，前體于miRBase中編號(hào)為MI0014240；成熟miR-3195于miRBase中編號(hào)為MIMAT0015079。20號(hào)染色體上microRNA與胃癌、肝癌、大腸癌等惡性腫瘤發(fā)病密切相關(guān)，進(jìn)一步研究顯示20q13.33與造血系統(tǒng)的惡性腫瘤有關(guān)[13]。芯片篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[14]，喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中存在較多上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的miRNA，說(shuō)明miRNA表達(dá)量變化在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。本研究中基因芯片檢測(cè)與PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-33b、miR-3195相對(duì)表達(dá)量均低于癌旁正常組織，可能是miR-33b、miR-3195在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮類似癌基因的作用[14]。相對(duì)于癌旁正常組織，喉鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-33b、miR-3195相對(duì)表達(dá)量更低，且臨床TNM分期越晚合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中miR-33b、miR-3195表達(dá)量越低，表明miR-33b、miR-3195下調(diào)表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)聯(lián)。患者組織中miR-33b、miR-3195表達(dá)量降低，且晚期與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者表達(dá)量低于早期和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，提示miR-33b、miR-3195表達(dá)下降，兩者可參與喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展，可能是該腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制，有待成為靶向治療新方向[15-16]。采用Spearman相關(guān)性分析法處理患者miR-33b、miR-3195表達(dá)量與臨床病理特征，結(jié)果顯示兩者與其呈負(fù)相關(guān)，miR-33b、miR-3195表達(dá)下調(diào)共同促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展[17]。

綜上所述，miR-33b、miR-3195在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，且與患者臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，可作為評(píng)估患者病情嚴(yán)重程度與預(yù)后的標(biāo)志物。