王巖璞，單守明，李 萍，韋 偉，金 悅

（寧夏大學農學院，銀川 750021）

釀酒葡萄果實中主要酚類物質按照化學結構可以分為類黃酮和非類黃酮2 大類，類黃酮主要包括花色苷、黃烷醇、黃酮醇等，非類黃酮主要包括酚酸、白藜蘆醇等物質[1]，這些酚類物質廣泛分布于果皮、果肉和種子中，它們不但參與葡萄果實中各種代謝活動，而且影響葡萄酒的口感、色澤和顏色穩(wěn)定性，對葡萄酒的許多感官品質（色澤、風味、澄清度）具有決定性作用，它還具有很強的抗氧化活性，是葡萄和葡萄酒中重要的保健功能成分[2-7]。葡萄果實中酚類物質代謝是多基因控制的數(shù)量性狀，結構基因和調節(jié)基因共同參與酚類物質的合成，品種、砧木、環(huán)境條件、脅迫、植物生長調節(jié)劑、成熟度和栽培措施等條件可在轉錄或轉錄后水平調節(jié)葡萄果實中這些基因的表達和酶活性，最終影響酚類物質的種類和含量[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）、類黃酮3′,5′-羥化酶（F3′5′H）和類黃酮3-O-葡糖基轉移酶（UFGT）都是苯丙烷代謝途徑及類黃酮代謝途徑中酚類物質合成的部分關鍵酶。寧夏賀蘭山東麓獨特的環(huán)境條件使其成為我國釀酒葡萄優(yōu)質生態(tài)產區(qū)之一[11]，隨著賀蘭山東麓釀酒葡萄產業(yè)的發(fā)展、栽培的品種也出現(xiàn)區(qū)域化和多樣化的發(fā)展趨勢，在現(xiàn)有赤霞珠、梅鹿輒、蛇龍珠、西拉等品種的基礎上，已開始栽培馬瑟蘭、小味爾多等釀酒葡萄品種，以實現(xiàn)葡萄酒的多樣化發(fā)展和提高經濟效益。

經前人對成熟期釀酒葡萄果實類黃酮和香氣物質組成和含量的測定發(fā)現(xiàn)[12]，馬瑟蘭中黃酮醇、黃烷醇和結合態(tài)萜烯含量較高，小味爾多游離態(tài)和結合態(tài)降異戊二烯類、游離態(tài)醛酮類香氣含量較高，2 個品種都具有種植潛力，但是并未比較2 個品種誰更突出。為此，筆者以馬瑟蘭、小味爾多為試材，通過對其果實中酚類物質積累及其PAL、C4H、F3′H、F3′5′H和UFGT基因相對表達量的比較，為馬瑟蘭、小味爾多2 個葡萄品種提供種植理論依據(jù)和技術指導，旨在為寧夏賀蘭山東麓優(yōu)質釀酒葡萄品種選擇提供更多的參考依據(jù)，以豐富寧夏產區(qū)釀酒葡萄種植品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在寧夏賀蘭山東麓的“寧夏現(xiàn)代農業(yè)綜合開發(fā)工程技術研究中心”釀酒葡萄試驗園進行。以5 年生紅色釀酒葡萄品種馬瑟蘭（Vitis viniferaL.cv.Marselan）和小味爾多（Vitis viniferaL.cv.Petit Verdot）為試材（自根苗），南北行向栽植，行株距3.0 m×0.8 m，“廠”字形樹形，葉幕高1.5 m，常規(guī)管理。試驗采用隨機區(qū)組重復3 次的設計方案，每個處理選擇生長勢相對一致且無病蟲害的葡萄樹30 株，負載量基本一致，分別于果實膨大期（花后45 d）、轉色前期（花后70 d）、完全轉色期（花后95 d）及采收期（花后120 d）采集各處理果實樣品，液氮速凍后貯于-84 ℃超低溫冰箱中用于生理指標、酚類物質含量及其合成關鍵酶基因的相對表達量的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 酚類物質的測定

取2.0 g 樣品于三角瓶中，加入5 mL 蒸餾水和45 mL 乙酸乙酯，避光振蕩30 min，收集上清液，重提3 次，合并上清液于圓底燒瓶中，用旋轉蒸發(fā)儀蒸干（33 ℃，避光），2 mL 色譜甲醇定容，0.45 μm 的濾膜過濾后備用。采用島津LC-20A 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）進行測定，C18色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 mm），流動相A：2%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，檢測波長280 nm。根據(jù)標準樣品的出峰時間來確定樣品中單體酚的成分，通過標準曲線來定量[13]。

1.2.2 果實品質的測定

采用蒽酮硫酸比色法測定采收期果實中可溶性糖含量，采用NaOH 滴定法測定可滴定酸含量，采用福林-肖卡法測定單寧含量，采用福林酚法測定總酚含量，采用比色法測定花色苷含量[14]。

1.2.3 總RNA 的提取及熒光定量PCR

用多糖多酚植物總 RNA 提取試劑盒（TIANGEN）提取果實的總RNA。以總RNA 為模板，用Takara PrimeScriptTMRT regent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進行反轉錄。內參基因為VvEF，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、類黃酮3′-羥化酶（F3′H）、類黃酮3′,5′-羥化酶（F3′5′H）、類黃酮3-O-葡糖基轉移酶（UFGT）的引物序列如表1。PCR 反應體系為1 μL的cDNA（模板濃度200 ng/μL），上、下游引物各0.5 μL，12.5 μL 的2×UltraSYBR Mixture（CWBIO），10.5 μL 的ddH2O，試驗結果采用2-△△CT進行相對定量計算[15]。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 23.0 和Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Origin 2018 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 2 個品種果實中酚類物質含量比較

從圖1 可以看出，馬瑟蘭與小味爾多果實中酚酸類物質隨著果實的發(fā)育不斷下降，花后95 d 達到最小值，極顯著低于其他時期。在花后45 d 和70 d時，小味爾多果實中酚酸類物質含量均極顯著高于馬瑟蘭；在花后95 d 和120 d 時，馬瑟蘭果實中酚酸類物質含量均極顯著高于小味爾多。

圖1 不同發(fā)育期馬瑟蘭與小味爾多酚類物質含量比較

隨著果實的發(fā)育，2 個品種果實中的黃烷醇與黃酮醇類物質含量不斷升高，分別在花后70 d 和花后95 d 時達到最高值，之后開始下降。在花后45 d和70 d 時，小味爾多果實中黃烷醇類物質含量均極顯著高于馬瑟蘭，在果實采收期，二者間黃烷醇含量無顯著差異（圖1）。

白藜蘆醇含量隨著果實發(fā)育總體呈上升趨勢，花后70 d 時為第1 個積累高峰，馬瑟蘭增長速率最快，為98.35%?；ê?20 d 時，白藜蘆醇含量迅速積累，其含量在5.87～9.70 mg/kg 之間，極顯著高于其他時期。在花后70 d 和120 d，馬瑟蘭果實中白藜蘆醇含量均極顯著高于小味爾多（圖1）。

采收期馬瑟蘭與小味爾多果實中酚酸類物質總含量無顯著差異（表2）。在6 種酚酸類物質中，以沒食子酸含量最高，占酚酸總含量的35.6%～66.2%；綠原酸含量最低，占酚酸總含量的3.2%～5.1%。馬瑟蘭果實中咖啡酸、綠原酸、苯甲酸和水楊酸含量比小味爾多高70.3%～199.2%，差異達到極顯著水平；但是沒食子酸含量比小味爾多低43.1%，差異也達到極顯著水平。

表2 馬瑟蘭與小味爾多采收期果實中酚類物質含量

黃烷醇類物質是果實中含量比例最高的一類酚類物質（表2）。在所測4 種黃烷醇類物質中，以兒茶素含量最高，占黃烷醇類物質總含量的62.2%～80.7%；表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量最低，占馬瑟蘭果實中黃烷醇類物質總含量的4.1%左右。馬瑟蘭果實中兒茶素和表兒茶素分別比小味爾多低19.0%和32.5%，差異達到極顯著水平。在小味爾多果實中兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量均較低。

馬瑟蘭和小味爾多果實中黃酮醇類物質總含量分別占總酚類物質含量的5.8%和10.2%（表2）。在6 種黃酮醇類物質中，以蘆丁含量最高，占黃酮醇類物質總含量的76.2%～87.6%；馬瑟蘭果實中桑色素含量最低，占黃酮醇類總含量的0.1%，小味爾多果實中山奈酚含量最低，占黃酮醇類總含量的0.2%左右。馬瑟蘭果實中槲皮素、山奈酚、白藜蘆醇物質含量分別比小味爾多高88.5%、232.1%和65.2%，而蘆丁、柚皮苷和桑色素分別比小味爾多低50.5%、45.5%和95.5%，差異均達到極顯著水平。

對采收期馬瑟蘭與小味爾多果實中17 種酚類物質成分進行主成分分析，結果如圖2、圖3 所示，第一主成分的貢獻率為95.7%，第二主成分的貢獻率為4.0%，累計貢獻率為99.7%。由載荷圖可知：咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、水楊酸（6）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（9）、兒茶素沒食子酸酯（10）、山奈酚（16）、白藜蘆醇（17）位于第一象限，與PC1和PC2 呈正相關。而沒食子酸（5）、兒茶素（7）、表兒茶素（8）、蘆?。?1）、柚皮苷（12）、桑色素（14）與PC1 和PC2 呈負相關。綠原酸（2）、阿魏酸（3）、楊梅素（13）、槲皮素（15）位于第四象限，與PC1 呈正相關，與PC2 呈負相關。結合圖2 和圖3 可知，馬瑟蘭的特征酚類物質為高含量的咖啡酸（1）、苯甲酸（4）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（9）、兒茶素沒食子酸酯（10）、白藜蘆醇（17），小味爾多果實中特征酚類物質為高含量的沒食子酸（5）、兒茶素（7）、表兒茶素（8）和蘆?。?1）。

圖2 馬瑟蘭與小味爾多成熟期果實單體酚組分主成分得分圖

圖3 馬瑟蘭與小味爾多采收期果實單體酚組分主成分載荷圖

2.2 2 個品種酚類物質合成關鍵酶基因相對表達量的比較

對苯丙烷代謝途徑及類黃酮代謝途徑中酚類物質合成的部分關鍵基因表達進行檢測，結果如圖4 所示。在整個轉色期小味爾多的VvPAL保持較高表達水平，轉色前期馬瑟蘭的VvPAL表達極顯著低于小味爾多；隨著果實轉色，VvPAL上調表達，完全轉色期（花后95 d）二者無顯著差異。隨后VvPAL基因表達量下降，采收期馬瑟蘭VvPAL相對表達量極顯著高于小味爾多。

由圖4 可知，隨著果實轉色，馬瑟蘭和小味爾多果實中VvC4H基因表達量不斷升高，完全轉色期小味爾多果實中VvC4H相對表達量極顯著高于其他時期，采收期馬瑟蘭VvC4H表達量極顯著高于其他時期。在果實發(fā)育各個時期，小味爾多果實中VvF3′H基因保持較高表達水平，除完全轉色期外均極顯著高于相同時期的馬瑟蘭。完全轉色期馬瑟蘭果實中VvF3′H的相對表達量最高，極顯著高于轉色前期。

圖4 不同發(fā)育期馬瑟蘭與小味爾多酚類物質合成關鍵酶基因相對表達量比較

馬瑟蘭果實中VvF3′5′H的相對表達量在轉色前期和完全轉色期很高，均極顯著高于采收期；在轉色前期和完全轉色期也均極顯著高于小味爾多。在果實采收期，小味爾多果實中VvF3′5′H的相對表達量極顯著高于馬瑟蘭，也極顯著高于小味爾多其他時期（圖4）。

馬瑟蘭與小味爾多果實中VvUFGT基因相對表達量的變化規(guī)律一致，在完全轉色期其相對表達量最高，此時小味爾多果實中VvUFGT相對表達量極顯著高于其他時期，也極顯著高于馬瑟蘭。馬瑟蘭果實中VvUFGT相對表達量在轉色前期和完全轉色期無顯著差異，均極顯著高于采收期（圖4）。

2.3 2 個品種果實品質的比較

在果實采收期，馬瑟蘭果實的平均單果重比小味爾多低20.1%，差異達到極顯著水平；其果實中可溶性糖、可滴定酸含量分別比小味爾多高4.8%和3.2%，但差異不顯著。馬瑟蘭果實中花色苷含量比小味爾多高19.6%，差異顯著；但是其果實中單寧、總酚含量分別比小味爾多低75.0%和24.3%，差異均達到極顯著水平（表3）。

表3 馬瑟蘭與小味爾多的果實品質

3 討論與結論

果實中酚類物質是葡萄酒中酚類物質的主要來源，酚類物質的組成和含量影響葡萄酒的口感、色澤和穩(wěn)定性，對葡萄酒的保健品質指標也具有決定性作用[2-6]。王瑜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，馬瑟蘭果皮中單寧和總酚含量低于蛇龍珠，但是五大類花色苷總含量顯著高于蛇龍珠。本研究結果表明，在采收期馬瑟蘭和小味爾多果實中酚酸類和黃烷醇類物質總含量無顯著差異，但是馬瑟蘭果實中白藜蘆醇含量極顯著高于小味爾多，其黃酮醇類物質總含量極顯著低于小味爾多。這表明，品種間基因型不同是果實中各種酚類物質積累差異產生的主要原因[16]。

主成分分析法廣泛應用在果實品質評價和新品種引選等方面[17]，本研究通過將采收期馬瑟蘭和小味爾多果實中17 種酚類物質進行主成分分析，結果表明，馬瑟蘭果實中特征的酚類物質是高含量的咖啡酸、苯甲酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、兒茶素沒食子酸酯和白藜蘆醇，小味爾多果實中特征酚類物質是高含量的沒食子酸、兒茶素和表兒茶素以及蘆丁。小味爾多果實的單寧和總酚含量均極顯著高于馬瑟蘭，這說明，馬瑟蘭果實中酚類物質均衡，花色苷含量高，小味爾多果實中酚類物質特征更突出，單寧高，收斂性更強。

PAL 是葡萄果實中酚類物質合成的第一個關鍵酶，調節(jié)釀酒葡萄果實中VvPAL、VvC4H等基因的表達和酶活性，可顯著提高采收時果實中酚類物質的含量和組成[18-21]。本研究結果表明，在果實采收期，馬瑟蘭果實中這些基因的相對表達量均極顯著高于小味爾多，果實中咖啡酸、白藜蘆醇含量也均極顯著高于小味爾多，阿魏酸和總花色苷含量均顯著高于小味爾多，這表明這些基因的相對表達量與相關酚類物質的積累基本一致。劉思凡等對6 個歐山種紅色釀酒葡萄品種果實成熟期進行單體酚含量和基因相對表達量測定，發(fā)現(xiàn)酚類物質的種類和含量在不同葡萄品種間呈顯著差異，這主要與葡萄果實中酚類合成基因的調控有關，且花色苷和酚類物質受VvPAL、VvC4H、VvF3′H、VvF3′5′H等基因調控[10]。

葡萄中柚皮素等上游酚類物質在F3′H、F3′5′H等酶的作用下逐步合成二氫黃酮醇類物質，隨后在UFGT 等酶的作用下形成穩(wěn)定的花色苷，環(huán)境、栽培條件、植物生長調節(jié)劑等調節(jié)這些基因的表達，也能提高沒食子酸等酚酸類和表兒茶素、蘆丁、桑色素等黃酮類物質的含量[22-24]。本研究結果表明，在轉色前期，小味爾多果實中VvPAL、VvF3′H基因的相對表達量均一直處于高水平，且顯著高于馬瑟蘭，在采收期小味爾多VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT表達量均極顯著高于馬瑟蘭，在采收期，小味爾多果實中單寧、總酚、沒食子酸、兒茶素和蘆丁均極顯著高于馬瑟蘭，這表明調節(jié)VvF3′H、VvF3′5′H、VvUFGT等基因表達也可顯著影響小味爾多果實中單寧、總酚和花色苷的含量。這與喬子純等[25]的研究結果相似。因此，酚類物質合成關鍵酶基因的時空差異表達可造成馬瑟蘭與小味爾多果實中酚類物質組成和含量的顯著差異。2 個葡萄品種都適合寧夏產區(qū)栽培，在果實采收期，酚類物質的積累小味爾多優(yōu)于馬瑟蘭。