楊 瑞，趙國康，張樹武，徐秉良，石海春

（甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070）

木霉菌是一種廣泛存在的生防真菌，不僅具有抗菌作用而且對植物生長有促進作用[1]。木霉生物菌肥具有生產(chǎn)成本低、安全無污染、改良土壤、減輕作物病蟲害、增加作物產(chǎn)量等優(yōu)點。此外，木霉生物菌肥能促進甜瓜、春油菜等作物的生長，能增加青椒、黃瓜的產(chǎn)量和改善其品質(zhì)[2-5]。曾慶才[6]研究發(fā)現(xiàn)，適量的哈茨木霉生物菌肥對茄子和苦瓜的生長有明顯的促進作用。木霉菌肥不僅廣泛應用于各種蔬菜上，同時也被應用于中藥材種植中，葉冰竹等[7]研究發(fā)現(xiàn)，深綠木霉D16 生物菌肥能促進丹參苗的生長和有效成分的積累。除此之外，木霉菌肥還可以用于植物病原線蟲的防治，王海明[8]研究結(jié)果表明，生物炭和麥麩木霉菌肥能夠顯著降低南方番茄地根結(jié)線蟲的種群數(shù)量并增加番茄的產(chǎn)量。

研究發(fā)現(xiàn)，生物菌肥對蘋果樹幼苗的生長具有明顯的促進作用[9-10]。此外，生物菌肥可以顯著提高果樹果實的含糖量、著色系數(shù)[11]。但木霉生物菌肥在蘋果樹上的應用尚未見報道，因此，本試驗基于形態(tài)指標和生理生化指標兩方面研究了木霉T6 生物菌肥對盆栽蘋果砧木幼苗生長及其抗氧化酶活性的影響，確定其最佳的施肥量。研究結(jié)果對合理應用木霉生物菌肥、有效促進蘋果砧木幼苗生長具有重要意義，以期為大規(guī)模應用提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木霉T6 生物菌肥由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學實驗室研制。蘋果砧木M9T337 幼苗，購自山東惠農(nóng)園藝科技有限公司。營養(yǎng)土為購自桃?；ɑ苁袌龅挠缁|(zhì)和綠能瑞奇營養(yǎng)基質(zhì)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理

選取生長健壯、長勢一致（株高約7 cm，莖粗約2.5 cm）、苗齡30 d 的M9T337 幼苗60 株，2019年12 月30 日移栽在花盆（10 cm×10 cm）中。盆土為混入木霉T6 生物菌肥的滅菌土，每盆土重500 g，移栽2 株。移栽后的幼苗置于氣溫為25 ℃、空氣相對濕度為65%的環(huán)境下，每隔3 d 澆1 次水。

試驗共設5 個處理：木霉T6 生物菌肥施肥量分別為土壤質(zhì)量的0.5%（T1）、1%（T2）、2%（T3）、3%（T4），對照（CK）不施菌肥。每2 株為1 次重復，重復6 次。

1.2.2 M9T337 幼苗生長指標的調(diào)查

M9T337 幼苗移栽3 個月后，測定其鮮重、根重、地徑、株高和根長，每個處理重復3 次。

1.2.3 M9T337 幼苗生理生化指標的測定及其方法

M9T337 幼苗移栽6 個月后，分別測定幼苗葉片和根系超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和可溶性蛋白含量，每個處理重復3 次。

結(jié)構(gòu)的主要荷載有：（1）結(jié)構(gòu)自重；（2）活荷載；（3）整體堆煤荷載；（4）局部堆煤荷載；（5）地震作用；（6）溫度作用；（7）風荷載。主要工況組合為：（1）整體堆煤荷載組合；（2）局部堆煤荷載荷載；（3）地震作用組合；（4）溫度作用組合等[1]。

（1）SOD 活性的測定。參考張建文[12]的方法，采用NBT 核黃素比色法測定。稱取葉片和根各0.5 g，分別剪碎后，各置于預冷的研缽中，加入2 mL預冷的提取介質(zhì)，在冰浴條件下研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入到離心管中，最終體積為10 mL，并于4 ℃下12 000 r/min 下離心30 min，獲得SOD 粗提液。然后，吸取20 μL 酶液，加入3 mL 反應液，4 000 lx 照光30 min，空白置暗處，對照（CK）與酶液同置于4 000 lx 條件下照光30 min，遮光保存，以空白調(diào)零，560 nm 比色。

SOD 總活性（吸光度/g）=（ACK-AE）×V／（FW×0.5×ACK）

公式中，ACK 為照光對照管的吸光度，AE 為樣品管的吸光度，V 為樣品提取液總體積（mL），F(xiàn)W 為植物樣品鮮重（g）。SOD 總活性單位為NBT光還原50%。

（2）POD 活性的測定。采用愈創(chuàng)木酚法測定。稱取葉片和根各1 g，分別剪碎后，各放入預冷的研缽中，加入5 mL pH 值6.0 磷酸緩沖液研磨成勻漿，將其移入100 mL 容量瓶中，經(jīng)磷酸緩沖液將殘渣沖洗入容量瓶并定容。混勻后取一定量放入離心管中，并于4 ℃下4 000 r/min 離心10 min，獲得POD粗提液。取20 μL 酶液與3 mL 反應液置于比色皿中，在470 nm 比色，每隔1 min 讀數(shù)1 次，共讀數(shù)3 次，并以每分鐘吸光度變化值表示酶活力的大小。

POD 總活性［ΔA470/（min·g）］=ΔA470×V/Va/FW

公式中，ΔA470 為在波長470 nm 下的吸光值的變化，V 為提取酶液總體積（mL），Va 為測定時所用酶液體積（mL），F(xiàn)W 為植物樣品鮮重（g）。

（3）CAT 活性的測定。采用鉬酸銨比色法測定。稱取葉片和根各0.5 g，各加入pH 值7.8 的磷酸緩沖液及少量石英砂，冰浴研磨成勻漿，分別轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中定容，并于4 ℃下4 000 r/min離心15 min，獲得CAT 粗提液。然后，將0.1 mL（或50 μL）酶液與2.5 mL 反應液置于比色杯中，240 nm 比色，每隔1 min 讀數(shù)1 次，共讀數(shù)3 次。

CAT 總活性［ΔA240/（min·g）］=ΔA240×V/Va/FW

（4）可溶性蛋白含量的測定。采用考馬斯亮藍法測定。稱取葉片和根各2 g，分別剪碎，各放入研缽中，加5 倍體積預冷的磷酸緩沖液，研磨成勻漿，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，于4 ℃下13 000g離心15 min，獲得可溶性蛋白提取液，吸取樣品提取液0.1 mL，加入4.9 mL 考馬斯亮藍G-250 溶液，充分混勻并靜置2 min 后在595 nm 波長下比色。

可溶性蛋白含量（mg/g）=C×V/Va/FW

公式中，C 為根據(jù)標準曲線得到的樣品管中蛋白質(zhì)含量（μg），V 為提取液總體積（mL），Va為測定所用酶液體積（mL），F(xiàn)W 為植物樣品鮮重（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010 軟件進行圖表制作，利用SPSS 22.0 軟件中的方差分析（ANOVA）多重比較（Duncan’s）對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉T6 生物菌肥施入量對M9T337 幼苗生長的影響

施用不同量木霉T6生物菌肥對M9T337幼苗株高、鮮重、地徑、根長和葉片數(shù)均有促進作用。處理3 個月后，與對照相比，木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的2%（T3）和3%（T4）時，對蘋果砧木M9T337 幼苗的生長促進作用最顯著。木霉T6生物菌肥施入量為2%（T3）時，幼苗株高、鮮重、地徑、根長和葉片數(shù)的增長率分別為38.01%、143.40%、30.21%、85.43%、206.38%；施入量為3%（T4）時，幼苗株高、鮮重、地徑、根長和葉片數(shù)的增長率分別為59.45%、120.75%、46.84%、83.27%、162.66%（表1）。

表1 施不同量木霉T6 生物菌肥M9T337 幼苗的生長指標

2.2 木霉T6 生物菌肥施入量對M9T337 幼苗SOD活性的影響

從圖1 可以看出，與對照相比，不同木霉T6生物菌肥施入量均能顯著提高M9T337 幼苗葉片和根系的SOD 活性。其中，就葉片而言，木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的2%（T3）和3%（T4）時，SOD 活性最高，顯著高于其他2 個木霉T6 生物菌肥和對照；就根系而言，SOD 活性隨木霉T6生物菌肥施入量的增加而提高，木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的3%（T4）時最高，對照最低，各處理間SOD 活性差異均顯著。

圖1 施入不同量木霉T6 生物菌肥M9T337 幼苗葉片和根系的SOD 活性

2.3 木霉T6 生物菌肥施入量對M9T337 幼苗POD活性的影響

從圖2 可以看出，M9T337 葉片和根系POD 活性均隨木霉T6 生物菌肥施入量的增加而提高，均以木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的3%（T4）處理最高，對照最低；且各處理間葉片和根系POD活性差異均顯著。

圖2 施入不同量木霉T6 生物菌肥M9T337 幼苗葉片和根系的POD 活性

2.4 木霉T6 生物菌肥施入量對M9T337 幼苗CAT活性的影響

從圖3 可以看出，M9T337 葉片和根系CAT 活性均隨木霉T6 生物菌肥施入量的增加而提高，均以木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的3%（T4）處理最高，對照最低；各處理間葉片和根系CAT 活性差異均顯著。

圖3 施入不同量木霉T6 生物菌肥M9T337 幼苗葉片和根系的CAT 活性

2.5 木霉T6 生物菌肥施入量對M9T337 幼苗可溶性蛋白含量的影響

從圖4 可以看出，M9T337 葉片和根系可溶性蛋白含量均隨木霉T6 生物菌肥施入量的增加而提高，均以木霉T6 生物菌肥施入量為土壤質(zhì)量的3%（T4）處理最高，對照最低；除T1 和T2 處理間根系可溶性蛋白含量差異不顯著外，其他各處理間葉片和根系可溶性蛋白含量差異均顯著。

圖4 施入不同量木霉T6 生物菌肥M9T337 幼苗葉片和根系的可溶性蛋白含量

3 討論與結(jié)論

土壤微生物與土壤肥力關系密切，對維持土壤的生態(tài)平衡有著重要作用[13]。吳曉嫻[14]研究表明，施入生物菌肥后，果園土壤中有益微生物增多，蘋果生長及產(chǎn)量顯著增加；王洋娟[9]發(fā)現(xiàn)，施用微生物菌肥可以明顯促進蘋果幼苗的生長，其株高、莖粗、枝長等均有不同程度的增加。本研究結(jié)果表明，施用不同量木霉T6 生物菌肥均能顯著促進蘋果砧木M9T337 幼苗的生長，當施肥量為土壤質(zhì)量的3%時M9T337 幼苗株高、鮮重、地徑、根長和葉片數(shù)均最大。陳偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，木美土里生物菌肥可以顯著改善蘋果樹的根系生長及枝條生長。本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致。

SOD、CAT 和POD 是生物演化過程中建立起來的生防生化系統(tǒng)關鍵酶，均能使植物體內(nèi)的活性氧及過氧化氫等物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚暂^低的物質(zhì)，降低或消除它們對植物膜脂的攻擊能力，使膜脂不被氧化而受到保護[16-18]。植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的變化可以反映植物體總代謝情況，植物體內(nèi)的可溶性蛋白大多是各種代謝所需的酶，也是重要的營養(yǎng)物質(zhì)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞的生物膜和生命物質(zhì)起到保護作用[19-20]。

曾慶賓等[1]研究了苗床添加木霉菌肥對煙苗生長和相關抗逆酶活性的影響，表明苗床添加中高濃度木霉菌肥可提高紅花大金元和云煙85 幼苗葉片和根系的CAT、POD 活性，促進煙草苗的生長和養(yǎng)分的吸收。小梅[21]研究發(fā)現(xiàn)，施用菌肥能顯著提高降香黃檀幼苗SOD、CAT 和POD 等保護酶的活性。本研究表明，不同木霉T6 生物菌肥施肥量處理的M9T337 幼苗葉片和根系SOD、POD、CAT 活性均顯著高于對照，且在施肥量為土壤質(zhì)量的3%時達到最高值，表明木霉T6 生物菌肥能提高植物的抗逆性，促進蘋果砧木幼苗的生長，這與前期研究結(jié)果基本一致。同時，本研究中發(fā)現(xiàn)3%木霉T6 生物菌肥處理后，蘋果砧木幼苗葉片和根系的可溶性蛋白含量均顯著上升。相關研究表明[22]，人參葉片中可溶性蛋白含量隨著生物菌肥濃度的增加呈顯著增加的趨勢，當施肥量為80 g/m2時達到最大值。

小梅[21]研究表明，降香黃檀幼苗保護酶活性和可溶性蛋白含量隨著水溶性復合微生物菌肥施用量的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而本研究發(fā)現(xiàn)蘋果砧木幼苗保護酶活性隨著菌肥施用量的增加呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，這可能與不同植物、不同處理和不同菌肥有關。木霉T6 生物菌肥能夠顯著提高M9T337 幼苗的株高、鮮重、地徑、根長和葉片數(shù)，提高蘋果砧木幼苗的抗氧化酶活性和可溶性蛋白的含量，進而促進蘋果砧木幼苗的生長。本試驗僅在盆栽條件下研究了木霉T6 生物菌肥對蘋果砧木幼苗生長的影響，其實際應用效果還需進一步通過田間試驗進行驗證。