張澤宇，王賢良，王帥，賈壯壯，閆海峰，毛靜遠(yuǎn)

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381； 2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由多種有害因素長期刺激引起的心室結(jié)構(gòu)代償性改變，功能上可表現(xiàn)為心肌收縮和/或舒張受限、射血分?jǐn)?shù)降低、心室壓升高等，造成體循環(huán)或肺循環(huán)瘀血[1]。CHF的根本原因是心室重構(gòu)，其重要機(jī)制之一是心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)[2-3]。根據(jù)該病疲乏、呼吸窘迫、水腫、血瘀等臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其病機(jī)歸納為本虛標(biāo)實(shí)，以心臟氣血陰陽虛衰與瘀血痰濕等病理產(chǎn)物相互作用為主[4]。優(yōu)化新生脈散方是毛靜遠(yuǎn)教授在多年臨床研究基礎(chǔ)上提出的治療CHF的經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、黨參、刺五加、丹參、醋鱉甲、茯苓、葶藶子、麥冬、枳殼等藥物組成，君藥黃芪補(bǔ)益元?dú)庖怨瘫?，補(bǔ)而不滯，兼有行濕之功；臣藥黨參、刺五加、丹參益氣以通脈；佐藥醋鱉甲、茯苓活血利水，葶藶子辛散苦瀉，性寒下降，開瀉肺氣以利治節(jié)；枳殼協(xié)助諸藥以行氣，麥冬養(yǎng)血復(fù)脈以防傷陰，各藥共用共奏益氣活血利水之功。前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，優(yōu)化新生脈散方具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗MF等作用，可顯著改善MF患者的生存質(zhì)量、心肌功能等[5-7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從微觀到宏觀多維度、多方面解析藥物調(diào)控疾病的機(jī)制，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測和分析中藥復(fù)方的作用機(jī)理，已成為藥物研究的新模式。分子對(duì)接能夠演算得出受體與配體之間的親和力數(shù)值以及一些結(jié)合形式，并通過這些條件將結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和篩選。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法對(duì)優(yōu)化新生脈散方治療CHF的作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行探索，旨在為后續(xù)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供線索與思路。

1 資料與方法

1.1 中藥有效成分的獲取基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)和本草組鑒(HERB，http://herb.ac.cn/)數(shù)據(jù)庫篩選優(yōu)化新生脈散方9味中藥的化學(xué)成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥35%、類藥性(druglikeness，DL)≥0.2為條件對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行初篩后，再通過SwissADME(http://www.swissadme.ch/)平臺(tái)以腸道吸收度(GI absorption)為Yes、DL為2個(gè)Yes及以上為條件進(jìn)行復(fù)篩，最終得到優(yōu)化新生脈散方的有效成分。

1.2 有效成分靶蛋白的獲取基于Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取有效成分的SMILES結(jié)構(gòu)式，并導(dǎo)入SEA數(shù)據(jù)庫(https://sea.bkslab.org/)預(yù)測有效成分的靶蛋白，最后通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對(duì)靶蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3 “成分-疾病”交集靶點(diǎn)的獲取通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)以Relevance score≥5為條件，chronic heart failure和myocardial fibrosis為關(guān)鍵詞，獲取CHF和MF的相關(guān)蛋白。將CHF靶蛋白、MF靶蛋白和優(yōu)化新生脈散方有效成分相關(guān)靶蛋白取交集，獲得交集蛋白，即為優(yōu)化新生脈散方治療CHF心肌纖維化的靶點(diǎn)蛋白，保存文件為“Drug-Disease”。

1.4 富集分析將“Drug-Disease”通過Rx64 4.0.2軟件進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，并以P<0.05為條件進(jìn)行篩選分析。GO功能富集分析可分為生物過程、分子功能和細(xì)胞組分，各取排名前10的功能繪制條形圖；將KEGG通路富集分析獲取的前30條通路繪制氣泡圖(縱坐標(biāo)為通路名稱，橫坐標(biāo)為基因占比，圓圈大小代表富集基因數(shù)目的多少，顏色為富集程度，紅色越深代表富集顯著性越強(qiáng))。通過查閱文獻(xiàn)篩選疾病相關(guān)通路并于KEGG富集結(jié)果中獲取富集蛋白，利用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)和Cytoscape-v3.8.2軟件篩選富集核心蛋白并對(duì)“通路-靶點(diǎn)”進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)將優(yōu)化新生脈散方活性成分和通路富集蛋白導(dǎo)入Cytoscape-v3.8.2軟件進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。其中，節(jié)點(diǎn)表示化合物和靶點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)之間相互作用關(guān)系。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證及篩選以富集核心蛋白為受體、對(duì)應(yīng)中藥成分為配體，進(jìn)行分子對(duì)接。將成分2D結(jié)構(gòu)通過Chem3D.exe軟件進(jìn)行3D轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，保存為lig.mol2；通過PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)并通過PyMOLWin.exe軟件對(duì)其進(jìn)行去除H2O和小分子配體處理，保存為rep.pdb；將rep.pdb和lig.mol2導(dǎo)入AutoDockTools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式，并確定活性位點(diǎn)；利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，選取與靶蛋白對(duì)接結(jié)合能最低的成分，利用PyMOLWin.exe將對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化新生脈散方的有效成分及其相關(guān)靶蛋白通過TCMSP和本草組鑒數(shù)據(jù)庫共獲得優(yōu)化新生脈散方有效成分83種，其中黃芪11種、黨參4種、刺五加11種、丹參29種、鱉甲5種、茯苓1種、葶藶子5種、麥冬18種、枳殼4種，蛋白預(yù)測并標(biāo)化處理后得到有效成分靶蛋白769種。根據(jù)OB值列出排名前20的化合物。見表1。

表1 優(yōu)化新生脈散方OB值排名前20位的化合物

2.2 “成分-疾病”交集靶點(diǎn)通過GeneCards數(shù)據(jù)庫以Relevance score≥5為條件，獲得CHF相關(guān)蛋白5 913種，MF相關(guān)蛋白725種，將CHF靶蛋白、MF靶蛋白及優(yōu)化新生脈散方有效成分的相關(guān)蛋白取交集后得到119個(gè)交集靶點(diǎn)。見圖1。

圖1 成分-疾病靶蛋白Venn圖

2.3 GO和KEGG富集分析GO功能富集分析共獲得2 388個(gè)功能條目，其中生物過程有2 178條，主要包括藥物反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、鈣離子穩(wěn)態(tài)等；細(xì)胞組分有52條，主要與膜區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞外基質(zhì)、膠原含量等有關(guān)；分子功能有158條，主要涉及生長因子(growth factor，GF)結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)結(jié)合、GPCRs活性、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。KEGG通路富集分析共獲得154條信號(hào)通路，其中磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)通路[8]、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路[9]、Ras相關(guān)蛋白1b(Ras-related protein 1b，Rap1)通路[10]、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)通路[11]、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)通路[12]等與CHF過程中MF的發(fā)生關(guān)系最為密切?！巴?靶點(diǎn)”拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)中紅色八邊形為上述通路，紫色圓形為一般富集蛋白，黃色圓形為核心富集蛋白，由此可知，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300(histone acetyltransferase p300，EP300)、MAPK1、EGFR、RAF原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase，RAF1)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)等蛋白可能對(duì)上述通路起到關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。見圖2-圖4，表2。

圖2 交集靶點(diǎn)的GO富集分析

圖3 交集靶點(diǎn)的KEGG富集分析

表2 核心富集蛋白

圖4 通路-靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖

2.4 “成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)共含75個(gè)節(jié)點(diǎn)和123條邊。圖5中左側(cè)環(huán)形代表藥物有效成分，咖啡色為黃芪成分、橙色為黨參成分、紫色為刺五加成分、綠色為丹參成分、紅色為鱉甲成分、灰色為茯苓成分、淡黃色為葶藶子成分、粉色為麥冬成分、青色為枳殼成分，多種顏色的節(jié)點(diǎn)代表藥物共有成分；右側(cè)環(huán)形代表通路富集蛋白，藍(lán)色為一般富集蛋白，黃色為核心富集蛋白。結(jié)果顯示，該方主要成分為異鼠李素、山奈酚、槲皮素、丹參酮IIA等，核心蛋白可受到多種藥物有效成分的調(diào)控作用。見圖5。

圖5 成分-靶點(diǎn)拓?fù)浞治鼍W(wǎng)絡(luò)圖

2.5 核心靶點(diǎn)與藥物有效成分的分子對(duì)接受體與配體的結(jié)合能低于-7 kJ·mol-1表示受體與配體之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力[13]。將核心靶蛋白與相應(yīng)主要成分進(jìn)行分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，靶蛋白與對(duì)應(yīng)化合物的結(jié)合能基本<-7 kJ·mol-1，將靶蛋白與其親和力最強(qiáng)的化合物構(gòu)建分子對(duì)接模式圖，由此說明藥物成分與作用靶點(diǎn)之間具有強(qiáng)烈的結(jié)合能力。見圖6，表3。

注：A：RAF1與異鼠李素；B：EP300與槲皮素；C：EP300與丹參酮IIA；D：STAT3與丹參酮IIA；E：HSP90AA1與丹參酮IIA；F：JUN與異鼠李素；G：MAPK1與丹參酮IIA；H：PRKCA與丹參酮IIA；I：IL6與丹參酮IIA；J：VEGFA與異鼠李素；K：EGFR與丹參酮IIA圖6 分子對(duì)接模式圖

表3 成分-靶點(diǎn)的分子對(duì)接數(shù)據(jù)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為CHF的病機(jī)為心氣虛損，血瘀痰阻，優(yōu)化新生脈散方諸藥合用，共奏益氣活血利水之功，通過辨證對(duì)藥物進(jìn)行加減，治療CHF實(shí)具良效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀的特點(diǎn)，有助于多層次闡明藥物的作用機(jī)制。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接方法對(duì)優(yōu)化新生脈散方、CHF以及MF的關(guān)系進(jìn)行探討，考察優(yōu)化新生脈散方在治療CHF過程中抑制MF的具體調(diào)控機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)。

GO功能富集分析結(jié)果表明，優(yōu)化新生脈散方對(duì)CHF過程中MF的治療作用涉及GF結(jié)合、GPCRs結(jié)合、GPCRs活性、RTK活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等。在缺血、缺氧、炎癥等多種致病因素的作用下，心肌組織發(fā)生慢性代償反應(yīng)，促進(jìn)心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac fibroblasts，CFs)等的病理反應(yīng)，增加促纖維化因子的分泌，GF、炎癥因子、胰島素與CFs表面的RTK結(jié)合，血管緊張素與CFs表面的GPCRs結(jié)合，促進(jìn)MF的發(fā)生[14-17]。KEGG富集分析結(jié)果表明，優(yōu)化新生脈散方可能主要作用于PI3K-Akt通路、MAPK通路、Rap1通路、cAMP通路、EGFR通路等信號(hào)通路，抑制CHF過程中MF的發(fā)展。PI3K具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，其中，Ⅰ型PI3K研究最為廣泛，包括ⅠA亞類和ⅠB亞類，ⅠA亞類主要由RTK激活，可在多種組織中表達(dá)；ⅠB亞類由GPCRs激活，主要表達(dá)于白細(xì)胞[18-19]。病理?xiàng)l件下，RTK被激活后可與PI3K p85亞基的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，解除對(duì)P110的抑制，P110被RTK招募后激活PI3K，催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate，PIP3)，PIP3再作為第二信使將Akt募集到質(zhì)膜上與3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1/2結(jié)合，活化的Akt通過磷酸化多種下游底物增強(qiáng)CFs轉(zhuǎn)錄因子的活性[20]。MAPK通路主要包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)、p38MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)，p38MAPK與JNK通路主要調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡和分化，ERK通路與CFs的增殖相關(guān)[9]。ERK通路胞膜受體包括RTK和血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin ii type 1 receptor，AT1)，活化受體首先將信號(hào)傳遞至Src酪氨酸激酶(Src tyrosine kinase，Src)以磷酸化接頭蛋白Shc，p-Shc與Grb2、SOS構(gòu)成Shc/Grb2/SOS復(fù)合物激活Ras蛋白，誘導(dǎo)Raf-1的磷酸化[21-22]。p-Raf-1以三級(jí)激酶級(jí)聯(lián)激活ERK1/2，進(jìn)而激活Elk-1調(diào)控c-fos基因，啟動(dòng)CFs增殖[23]。心肌缺血/再灌注損傷小鼠模型中，抑制Rap1通路可減少心肌梗死面積、減輕心肌細(xì)胞肥大、炎癥和MF程度[10,24]。cAMP信號(hào)通路的激活可抑制CFs的DNA合成，進(jìn)而阻止CFs的增殖、分化、遷移和侵襲，使膠原生成減少[11,25]。EGFR通路的激活可上調(diào)促纖維化基因，增強(qiáng)Ⅰ、Ⅲ型膠原合成，引起MF和瘢痕，維持病理?xiàng)l件下心肌結(jié)構(gòu)的完整性，如雙調(diào)蛋白通過激活EGFR依賴性通路加重心肌梗死小鼠MF及心功能不全，分泌型磷脂酶A2-IIA可通過調(diào)節(jié)EGFR 轉(zhuǎn)錄激活以促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞分化，Ang II/醛固酮可激活TRIF/EGFR通路誘導(dǎo)小鼠心臟炎癥、MF、肥大和功能障礙等[12,26-27]。

通過富集篩選核心蛋白、“通路-靶點(diǎn)”拓?fù)浞治?、“成?靶點(diǎn)”拓?fù)浞治黾胺肿訉?duì)接得出，優(yōu)化新生脈散方主要成分為異鼠李素、槲皮素、山奈酚、丹參酮IIA等，通過干預(yù)EP300、MAPK1、RAF1、JUN等核心蛋白調(diào)控PI3K-Akt通路、MAPK通路、EGFR通路等信號(hào)通路?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，異鼠李素可通過阻斷PI3K-Akt通路、TGFβ通路等信號(hào)通路，抑制I型膠原蛋白α1 mRNA的表達(dá)，減輕甚至逆轉(zhuǎn)血管緊張素II所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和MF[28-29]；槲皮素可結(jié)合SIRT5，促進(jìn)IDH2去糖基化，維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在炎癥條件下保護(hù)小鼠心肌細(xì)胞，改善MF，降低CHF患者的住院率和病死率，同時(shí)，還可預(yù)防心臟脂肪堆積，減少高脂飲食誘導(dǎo)的MF、心肌細(xì)胞肥大、氧化應(yīng)激和血管稀疏，通過調(diào)節(jié)miR-223-3p/FOXO3增加自噬，預(yù)防異丙腎上腺素誘導(dǎo)的MF。此外，槲皮素二水合物能夠抑制Ang II誘導(dǎo)的CFs增殖和分化[30-33]；山奈酚可抑制AngII誘導(dǎo)的CFs增殖和活化及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白的合成，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達(dá)，減輕MF程度[34-35]；丹參酮IIA可減少ROS生成、抑制NADPH氧化酶和TGFβ1/SMAD-2/3通路及調(diào)控microRNA，以抑制CFs增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(如膠原和纖維連接蛋白)沉積，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡，發(fā)揮抗MF作用[36]。

綜上所述，優(yōu)化新生脈散方可能是通過異鼠李素、槲皮素、山奈酚、丹參酮IIA等多種有效成分作用于EP300、MAPK1、RAF1、JUN等核心蛋白，進(jìn)而調(diào)控PI3K-Akt通路、MAPK通路、Rap1通路、cAMP通路、EGFR通路等信號(hào)通路，發(fā)揮抑制CFs過度增殖，恢復(fù)Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成與分解動(dòng)態(tài)平衡，減少ECM的病理性積聚，降低心肌中間質(zhì)成分比重，最終改善MF的作用。本研究僅通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)分析藥物活性成分的吸收情況和結(jié)合能力，并未衡量其在復(fù)方中的含量及相互反應(yīng)等問題，尚存在一定的局限性，但可為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供大致的參考方向。