雷 陽，喬 寧，苗如意，楊玉花，吳越莉

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 太原 030031； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室·山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因與資源研究中心 太原 030031）

重金屬鉛（Pb）是植物體內(nèi)的非必需元素，可造成植物細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）過量積累，進(jìn)而導(dǎo)致植物生長遲滯、光合作用受阻，甚至細(xì)胞死亡等嚴(yán)重的生理脅迫。隨著我國工業(yè)化和城市化的持續(xù)發(fā)展，工礦企業(yè)排放的三廢、汽車尾氣中的鉛離子大量進(jìn)入土壤和地下水中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國土壤中的鉛等重金屬污染情況極其嚴(yán)重，污染超標(biāo)率高達(dá)7.0%，而其中工業(yè)園區(qū)和礦區(qū)的土壤污染最為嚴(yán)重，超標(biāo)率分別高達(dá)29.4%和33.4%。山西省經(jīng)濟(jì)發(fā)展長期依賴重工業(yè)和礦產(chǎn)資源，土壤中的鉛污染嚴(yán)重，已經(jīng)成為經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型、農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的限制性因素。

谷胱甘肽（GSH）是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的多肽類活性小分子，一方面可直接或間接清除ROS，同時(shí)也能夠通過形成多聚物進(jìn)而螯合鉛等重金屬離子，降低重金屬的脅迫危害。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是合成GSH 前體的關(guān)鍵酶，其活力直接決定了GSH 合成速率，丁硫堇（BSO）是γ-GCS 的抑制劑，能夠有效減少植物內(nèi)源GSH 含量。Estrella-gómez 等研究表明，小槐葉可通過激活基因的表達(dá)來增加谷氨酰胺合成酶（GS）合成量，進(jìn)而提高GSH 含量來應(yīng)對(duì)鉛脅迫對(duì)細(xì)胞的損害。Nahar 等研究表明，GSH 可有效提高干旱脅迫下綠豆的生物量、光合色素含量、抗氧化物酶活性，有效緩解干旱脅迫對(duì)綠豆幼苗生長的抑制作用。Zhou 等的研究表明，GSH 可有效緩解鹽脅迫對(duì)番茄光合作用的抑制，并提高抗氧化物酶活性，而添加BSO 則會(huì)起到與GSH 相反的作用。

近年來，隨著我國鉛污染的情況不斷惡化，科研工作者做了大量關(guān)于緩解植物鉛脅迫的研究。然而，關(guān)于GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒生理影響的研究尚未見報(bào)道。筆者針對(duì)山西省土壤的鉛污染問題，探究了鉛脅迫下不同濃度GSH 和1 mmol·LBSO對(duì)辣椒幼苗各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響，旨在探討GSH 對(duì)辣椒逆境響應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為辣椒耐重金屬栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)苯菲贩N為晉椒503，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院辣椒育種團(tuán)隊(duì)提供。鉛離子供體Pb（NO）和谷胱甘肽GSH 均購自Sigma 公司，BSO 購自北京百靈威科技有限公司。

1.2 方法

試驗(yàn)于2020 年3 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（龍城校區(qū)）進(jìn)行。選取均勻無病害的晉椒503 辣椒種子，用滅菌水在室溫下浸泡4～5 h。然后用75%乙醇沖洗20 s，15%NaClO 沖洗15 min，滅菌水洗滌3 次，放入真空干燥箱40 ℃烘干30 min，播種于72 孔的穴盤中，25 ℃（光/暗12 h/12 h）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d 后，取長勢(shì)一致的幼苗，分成CK 對(duì)照組和5 個(gè)處理組移栽至營養(yǎng)箱中，土壤營養(yǎng)液于處理時(shí)直接加入，GSH 和BSO 以葉片噴施的方式于每日08：00 進(jìn)行噴施，詳見表1。在處理12 d 后測定根長、株高、地上/地下部干質(zhì)量、根冠比等指標(biāo)，每處理測定3 株，3 次重復(fù)。將收集的辣椒幼苗從根部和莖部切開，分別于105 ℃殺青15 min，80 ℃烘干至質(zhì)量恒定，分別稱量地上部和地下部干質(zhì)量，地下部干質(zhì)量與地上部干質(zhì)量之比即為根冠比。

表1 試驗(yàn)處理

1.3 幼苗生理指標(biāo)的測定及方法

葉綠素a、b 和類胡蘿卜素含量的測定：避光條件下取晉椒503 辣椒幼苗葉片2 g，采用丙酮溶解法提取，然后分別在470、649 和665 nm 波長下測定。

采用Murshed 等的方法測定AsA（抗壞血酸）、脫氫抗壞血酸（DHA）、GSH（谷胱甘肽）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量以及超氧陰離子（O）產(chǎn)生速率和HO含量。采用蘇州格銳思生物技術(shù)有限公司試劑盒測定過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、谷胱甘肽還原酶（GR）和γ-GCS 酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016 整理數(shù)據(jù)和作圖；采用SAS 1.2 分析數(shù)據(jù)，用Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗生物量的的影響

由表2 可知，與CK 相比，Pb 處理后辣椒幼苗根長、株高、地上部和地下部干質(zhì)量以及根冠比均顯著下降，降幅分別為30.83%、18.93%、32.99%、59.00%、38.24%。在鉛脅迫下，4 個(gè)噴施GSH 處理比Pb 處理幼苗根長、株高、地上部和地下部干質(zhì)量以及根冠比均顯著提高；除根冠比外，噴施5、10、15 mmol·LGSH 對(duì)辣椒幼苗生物量均顯著高于1 mmol·L的GSH 處理，而3 個(gè)高濃度GSH 處理之間幼苗生物量差異均不顯著。與Pb 處理相比，PbBSO 則會(huì)顯著降低辣椒幼苗根長、株高、地下部干質(zhì)量，降低地上部干質(zhì)量、根冠比。結(jié)果表明，GSH 可有效緩解鉛脅迫對(duì)辣椒幼苗的毒害，促進(jìn)辣椒幼苗生物量的增加，但仍比CK 有顯著降低，未能恢復(fù)至CK 的水平。

表2 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗生物量的影響

2.2 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片光合色素含量的影響

由表3 可知，與CK 相比，Pb 處理的葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著降低，降幅分別為為46.83%、40.71%和49.17%。在鉛離子脅迫下，4 個(gè)噴施GSH 處理與Pb 處理相比，辣椒幼苗葉片的葉綠素a 含量分別顯著提高12.65%、49.38%、47.18%和49.90%，葉綠素b 含量分別顯著提高33.20%、51.45%、54.15%和49.38%，類胡蘿卜素分別顯著提高18.75%、54.32%、62.20%和51.04%；其中PbGSH5、PbGSH10 和PbGSH15 光合色素含量均顯著高于PbGSH1，而前3 者之間差異均不顯著。與其他處理相比，噴施BSO 則會(huì)顯著降低辣椒幼苗葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和葉綠素a+葉綠素b 的含量。表明GSH 可有效緩解鉛離子對(duì)辣椒光合色素的破壞，從而提升幼苗對(duì)鉛脅迫的耐受性。

表3 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗光合色素的影響

2.3 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片抗氧化物酶活性的影響

由圖1 可知，與CK 相比，Pb 處理的葉片CAT、APX、POD 和SOD 活性均顯著降低，降幅分別為44.28%、46.89%、46.94%和36.09%。在鉛脅迫下，與Pb 處理相比，外源GSH 對(duì)辣椒葉片中的抗氧化物酶活性均有顯著提高。其中，PbGSH5 處理的效果最為突出，其CAT 和POD 活性均顯著高于其他GSH 處理，APX 和SOD 活性均顯著高于PbGSH1和PbGSH15，但與PbGSH10 差異不顯著。當(dāng)GSH濃度達(dá)到15 mmol·L時(shí)，4 種抗氧化物酶活性均出現(xiàn)下降。與Pb 處理相比，鉛脅迫下噴施BSO，則會(huì)顯著降低POD 和SOD 活性，而CAT、APX 活性均與Pb 處理差異不顯著。表明GSH 對(duì)抗氧化物酶活性的影響具有兩面性，低濃度的GSH 可有效提升抗氧化物酶活性，而過高的濃度則會(huì)降低其活性。

圖1 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒葉片抗氧化物酶活性的影響

2.4 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片AsA-GSH 循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

由圖2 可知，與CK 相比，Pb 處理辣椒幼苗葉片MDHAR、DHAR、GR 和γ-GCS 活性均顯著降低，降 幅 分 別 為29.43% 、34.47% 、46.40% 和38.60%。與Pb 處理相比，在鉛脅迫下噴施GSH 可顯著提高辣椒葉片MDHAR、DHAR、GR 活性，其中，PbGSH5 和PbGSH10 處理的效果較好，當(dāng)GSH濃度達(dá)到15 mmol·L時(shí)，3 種酶的活性均比Pb-GSH10 處理顯著降低；γ-GCS 活性則與其他3 種酶活性相反，與Pb 處理相比，在鉛脅迫下噴施1 mmol·LGSH 時(shí)，辣椒幼苗葉片γ-GCS 活性略有提高，但與Pb 處理差異不顯著；而當(dāng)噴施其他濃度GSH 后反而會(huì)顯著降低其活性，且噴施濃度越大，γ-GCS 活性越低。在鉛脅迫下噴施BSO 后，MDHAR、GR 和γ-GCS 活性均比Pb 處理顯著降低，降幅分別為8.81%、21.88%和63.42%。

圖2 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒葉片AsA-GSH 循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

2.5 GSH對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片AsA循環(huán)的影響

由圖3 可知，Pb 處理比CK 處理的AsA 含量顯著減低22.17%，DHA 含量顯著升高53.21%，AsA/DHA 顯著降低49.19%。與Pb 處理相比，在鉛脅迫下4 種濃度GSH 處理均可顯著提升辣椒葉片AsA 含量和AsA/DHA，并顯著降低DHA 含量，且濃度越高效果越明顯。其中，PbGSH15 處理的AsA 含量不僅比Pb 處理顯著上升33.44%，且比CK 顯著提高了3.86%。噴施BSO 后，與Pb 處理相比，辣椒葉片AsA 含量和AsA/DHA 均顯著降低，DHA 含量顯著升高。從正反兩方面表明，GSH可緩解甚至逆轉(zhuǎn)Pb 脅迫對(duì)辣椒AsA 循環(huán)的抑制作用。

圖3 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒葉片AsA 循環(huán)的影響

2.6 GSH對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片GSH循環(huán)的影響

由圖4 可知，與CK 相比，Pb 處理的辣椒葉片中GSH、GSSG 含量顯著上升，增幅分別為25.85%、117.86%，同時(shí)GSH/GSS 顯著降低了42.23%。與Pb 處理相比，在鉛脅迫下噴施GSH 可不同程度地提高辣椒幼苗葉片中GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG，其中PbGSH15 處理的效果最為突出，與Pb處理相比分別增加了182.21%、42.02%和98.71%。噴施GSH 合成抑制劑BSO 可顯著降低GSH 含量和GSH/GSSG，與Pb 處理相比降幅分別為35.39%和31.77%，GSSG 含量比Pb 處理下降，且差異顯著。

圖4 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒葉片GSH 循環(huán)的影響

2.7 GSH對(duì)鉛脅迫下辣椒幼苗葉片ROS的影響

由圖5 可知，與CK 相比，Pb 處理辣椒葉片中O產(chǎn)生速率和HO質(zhì)量摩爾濃度均顯著升高，增幅分別為71.51%、64.22%。表明鉛脅迫可顯著升高辣椒幼苗葉片中ROS 含量。與Pb 處理相比，4 個(gè)噴施外源GSH 處理均可顯著降低鉛脅迫下的辣椒葉片中O產(chǎn)生速率和HO質(zhì)量摩爾濃度，其中PbGSH15 處理的效果最為明顯，與Pb 處理相比降幅分別為31.09%、30.30%，差異顯著。噴施BSO 則會(huì)顯著提升辣椒葉片O產(chǎn)生速率和HO質(zhì)量摩爾濃度，分別比Pb 處理提高了37.16%和30.78%。正反兩方面表明GSH 可有效提升辣椒幼苗清除體內(nèi)ROS 的能力，緩解鉛離子對(duì)辣椒葉片的氧化脅迫。

圖5 GSH 對(duì)鉛脅迫下辣椒葉片O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

3 討論與結(jié)論

植物體內(nèi)過量鉛會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)的ROS 迅速積累，引起細(xì)胞膜過氧化，產(chǎn)生氧化脅迫，破壞光合色素穩(wěn)定性，阻礙能量的正常轉(zhuǎn)化，嚴(yán)重影響植物生物量的增長。本研究在鉛脅迫下，辣椒幼苗的根長、株高、地上部和地下部干質(zhì)量、葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量以及總?cè)~綠素含量均顯著下降，這與Zhou 等在番茄上的研究結(jié)果相一致?？寡趸锩赶到y(tǒng)的關(guān)鍵酶有POD、CAT、SOD 和APX，O經(jīng)由SOD 催化為HO，而HO可分別由POD 催化還原型輔酶代謝、APX 催化AsA 代謝，或者是CAT 直接清除。本研究在鉛脅迫下，辣椒POD、CAT、SOD 和APX 活性均顯著降低，在對(duì)鉛脅迫下的辣椒幼苗噴施GSH 后，4 種抗氧化物酶活性均顯著提高，但過高的GSH 濃度反而會(huì)一定程度降低它們的活性，這與邢春艷等的研究結(jié)果相一致。

GSH 在抗氧化劑系統(tǒng)中起到核心作用，GSH和AsA 可直接還原ROS，GSH 的氧化產(chǎn)物為GSSG，AsA 的氧化分為兩步，分別生成單脫氫抗壞血酸（MDHA）和DHA；GR 可將GSSG 還原為GSH，實(shí)現(xiàn)GSH 的循環(huán)再生；以GSH 為電子供體，MDHAR 和DHAR 酶可分別將MDHA 和DHA 還原為AsA，實(shí)現(xiàn)AsA 的循環(huán)再生。本研究結(jié)果表明，在鉛脅迫下，辣椒葉片中關(guān)鍵酶的活性、AsA 含量、AsA/DHA 和GSH/GSSG 均顯著降低；GSH、GSSG 和DHA 含量顯著升高。與Pb 處理相比，在鉛脅迫下補(bǔ)充外源GSH 可顯著提高GR、DHAR 和MDHAR 活性，從而提升AsA-GSH循環(huán)的還原態(tài)比例；而γ-GCS 活性則在噴施1 mmol·LGSH 時(shí)略有提高，但與Pb 處理差異不顯著，之后隨著GSH 濃度的增加而逐漸降低；添加BSO 可降低AsA-GSH 循環(huán)的關(guān)鍵酶活性以及還原態(tài)/氧化態(tài)比例。從正反兩方面表明外源GSH 一方面可直接補(bǔ)充內(nèi)源GSH，另一方面可通過激活A(yù)sA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)關(guān)鍵酶活性來提升AsA-GSH的循環(huán)速率，加快清除鉛離子引起的ROS 脅迫。同時(shí)本研究也表明在辣椒體內(nèi)GSH 對(duì)γ-GCS 酶具有反饋抑制作用，這與前人的研究結(jié)果相一致。在正常狀態(tài)下，O和HO等ROS 的生成和清除處于穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)平衡。過量的鉛離子會(huì)使平衡發(fā)生移動(dòng)，在細(xì)胞內(nèi)大量積累ROS，造成細(xì)胞氧化脅迫，影響植物的生長、發(fā)育、光合作用、逆境響應(yīng)。本研究表明辣椒幼苗受到鉛脅迫后O產(chǎn)生速率和HO含量上有顯著升高，外源GSH 可有效降低ROS 含量，而BSO 則會(huì)加劇鉛脅迫下ROS 的積累，這與蔡仕珍等的研究結(jié)果相一致。

本研究以鉛脅迫下的晉椒503 幼苗為材料，探究了不同濃度GSH 和BSO 對(duì)辣椒幼苗各項(xiàng)生理生化參數(shù)的影響。結(jié)果表明，在鉛脅迫下，外源噴施GSH 可以增加辣椒幼苗的生物量，增加葉片中光合色素含量，提高抗氧化物酶等的活性和AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)還原態(tài)/氧化態(tài)比例，進(jìn)而清除O和HO等ROS；添加GSH 合成抑制劑BSO 則會(huì)逆轉(zhuǎn)上述作用。綜上所述，15 mmol·LGSH 可有效緩解鉛脅迫對(duì)辣椒造成的生理損害，進(jìn)而提高辣椒抵抗鉛脅迫的能力。