馮萬宇 陳亮 苗艷 張艷 蘭世捷 沈思思 李丹 張蕾 武曉東 王麗坤 金振華 王巖

摘 要：為研究恩諾沙星懸乳劑在來航雞體內的動力學，以肌注給藥后利用RP-HPLC法測定雞血漿中恩諾沙星濃度，恩諾沙星Ci-Ti數據采用MCPKP藥物動力學計算機程序進行處理。肌注恩諾沙星后的Ci-Ti數據符合一級吸收二室開放性模型，其藥代動力學參數T1/2α、T1/2β、Vd、CLB和AUC分別為0.25±0.04 h、5.26±0.81 h、4.53±1.07 L/kg、0.61±0.11 L/kg·h、17.39±3.92 μg/mL·h;試驗結論顯示雞注射恩諾沙星后，在體內分布廣泛，血藥維持時間長、消除緩慢，有較好的臨床應用前景。

關鍵詞：恩諾沙星;懸乳劑;藥代動力學;雞

恩諾沙星屬畜禽專用的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，具有廣譜抗菌、強力殺菌、作用迅速和在動物體內分布廣的優(yōu)點，與其它抗生素之間無交叉耐藥，已被廣泛應用于國內外家禽、家畜及水產漁業(yè)等動物臨床領域[1，2]。目前，臨床應用的多為普通注射液，每日多次用藥給臨床應用帶來許多不必要的麻煩，研制長效制劑是獸醫(yī)臨床用藥之所需[3，4]。

懸乳劑是固體懸浮體與乳狀液混合形成的懸浮乳狀體系，也有人稱其為三相混合物或者懸浮體系[5，6]，通過緩控藥物釋放來發(fā)揮其長效作用[7，8]，其研究始于20世紀80年代后期。

本研究選擇恩諾沙星懸乳劑為模型藥物，考察恩諾沙星懸乳劑特性，并以來航雞為動物模型來研究恩諾沙星懸乳劑的藥代動力學特征，克服現(xiàn)有劑型用藥次數多、作用時間短及易產生應激反應等方面存在的不足，打破傳統(tǒng)給藥方式的束縛，為獸用藥物新劑型的研發(fā)提供技術參考，也為恩諾沙星懸乳劑實現(xiàn)臨床用藥提供理論依據[9～12]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 120日齡健康來航雞10只，購于訥河天禹禽業(yè)有限公司，平均體重（1.54 ±0.43）kg。

1.1.2 藥品與儀器 藥品：恩諾沙星標準品，凈含量100%，批號H201501，購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;恩諾沙星粉劑，浙江新昌國幫獸藥廠，批號141108-2，凈含量99%;恩諾沙星懸乳劑，規(guī)格5 mL：500 mg，批號20200716，本研究室自制;乙腈為色譜純，磷酸、氫氧化鈉和三乙胺為分析純。

儀器：Agilent 1200液相色譜儀，日本santec公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗動物給藥 將10只120日齡健康來航雞預飼7 d后，取恩諾沙星懸乳劑搖勻，肌肉注射，注射劑量為20 mg/kg·bw。

1.2.2 血樣采集 分別在給藥后0、0.0833、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h和60 h采取血樣1.5～2 mL，置于裝有適量肝素的試管中，搖勻，經4 000 r/min離心15 min，分離后取出血漿，置于-20 ℃冰箱冷凍保存、備用。

1.2.3 血漿樣品處理 吸取血漿100 μL，加入0.5 mL乙腈，漩渦振蕩混合1 min，以15 000 r/min離心10 min，取上清液于60 ℃恒溫水浴鍋中氮氣吹干。加0.5 mL流動相，漩渦混合1 min，15 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，以0.22 μm微孔濾膜過濾上清液，取樣品20 μL進行測定。

1.2.4 色譜條件 固定相Wasters-C18反相柱（250mm×4.6mm，5μm）;流動相0.05 mol/L H3PO4溶液/三乙胺-乙腈（82∶18，體積比）;檢測器激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為450 nm;柱溫20 ℃;流速1.0 mL/min;進樣量20 μL;最低檢測限0.01 μg/mL;用外標法測定;流動相使用前經0.5 μm濾膜濾過，超聲振蕩15 min。

1.3 方法確證

1.3.1 方法專屬性 取空白血漿100μL，按照1.2.3項操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進行檢測，可得空白血漿色譜圖;取空白血漿100μL，加入恩諾沙星標準品10 μg，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋，使其恩諾沙星含量為10 μg/mL，按照1.2.3項操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進行檢測，可得含恩諾沙星的血漿標準色譜圖;取肌注4 h恩諾沙星待檢血漿樣品，按照1.2.3項操作處理，處理后的樣品用高效液相色譜儀進行檢測，可得恩諾沙星待檢樣品血漿色譜圖。

1.3.2 恩諾沙星血漿標準曲線和線性范圍 稱取50 mg恩諾沙星對照品，用0.03 mol/L氫氧化鈉稀釋為濃度1 mg/mL儲備液為母液，4 ℃保存?zhèn)溆?。各離心管中加入0.5 mL空白血漿，將恩諾沙星對照品母液加入其中，使各藥物濃度為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、3.0 μg/mL和5.0 μg/mL，依1.2.3項處理后，從低濃度到高濃度作HPLC分析。每個濃度作3次重復，用重復性試驗好的數據，以縱坐標為峰面積、橫坐標為質量濃度，求線性回歸方程和相關系數，并制作血漿標準曲線。根據相關系數，對血漿中恩諾沙星線性范圍進行估測。

1.3.3 回收率測定 取空白血漿，將恩諾沙星對照品母液加入其中，使其濃度為0.1、0.5、1.5 μg/mL，依1.2.3項處理后進行HPLC數據分析，并以恩諾沙星血漿標準曲線回歸方程計算其濃度，以其濃度和加入量進行比較，同時計算不同濃度恩諾沙星回收率，每個作3次重復。

1.3.4 方法精密度的測定 在空白血漿中加入恩諾沙星母液，使?jié)舛确謩e為0.1、0.5、1.5 μg/mL，按1.2.3項處理后，測得恩諾沙星峰面積，每個濃度日內作3次重復，共作3個批次。計算批間及批內峰面積離散系數CV，估算本定量方法的精密度。

1.4 統(tǒng)計學處理

試驗數據用Mintab 17軟件處理，結果以平均值±標準差表示;藥-時數據采用MCPKP藥物動力學計算機程序軟件進行計算、統(tǒng)計和擬合模型，并通過相關系數判斷擬合模型好壞，同時計算出藥動學有關參數。

2 結果與分析

2.1 方法確證數據與分析

2.1.1 恩諾沙星專屬性分析 在本色譜條件下，恩諾沙星保留時間為5.24～5.27 min，與雜峰分離良好。空白血漿色譜圖見圖1，空白血漿+恩諾沙星標準品色譜圖見圖2，待檢血漿樣品恩諾沙星色譜圖見圖3。

2.1.2 恩諾沙星血漿標準曲線測定及線性范圍測定 將恩諾沙星對照品添加至血漿中制成不同濃度溶液進行測定，測定結果如表1所示。以峰面積x對恩諾沙星標準液濃度Y求得回歸方程：Y=94020x+4579.0，構建的恩諾沙星血漿標準曲線如圖4。相關系數r=0.9994，表明待測樣品中恩諾沙星濃度在0.02～5.0 μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系，最低檢測限為0.02 μg/mL。

2.1.3 回收率試驗結果 血漿樣品中恩諾沙星的回收結果見表2。由表2可見，在0.1～1.5 μg/mL范圍內，血漿樣品中恩諾沙星平均回收率為89.53%，測定結果準確，符合藥動學要求，方法可行。

2.2 恩諾沙星懸乳劑在雞體內藥物動力學分析

雞注射恩諾沙星懸乳劑后，血中藥物濃度隨時間變化情況見表4。經藥動學軟件分析進行濃度-時間擬合，結果表明恩諾沙星懸乳劑在雞體內的消除符合一級吸收二室開放模型，動力學參數見表5。藥物-時間曲線圖見圖5。

3 討論

恩諾沙星特點之一是起效快，但從體內排出去也快，常規(guī)注射劑型一般需要用藥2次/d。已有試驗研究證實，應用恩諾沙星混懸液治療人工誘發(fā)動物大腸桿菌病，應用療效確實可行，給藥一次即可控制病情[11，12];對重癥動物或頑固細菌感染疾病，療效也相當滿意[13，14]。研究長效恩諾沙星注射液肌注后在豬體內的藥物動力學，研究結果表明，經5.64 h達到最高濃度4.86 μg/mL，吸收半衰期和消除半衰期分別為2.42 h和19.47 h，有效濃度維持時間為128.73 h，AUC為166.96 mg/L·h，

吸收半衰期顯著延長，達峰時間極顯著推遲（p<0.01），消除半衰期也顯著長于恩諾沙星注射液[15-16]。本試驗結果表明，對來航雞肌注20mg/kg恩諾沙星懸乳劑后在體內的藥代動力學參數顯示，在雞體內能迅速達到較高濃度，血漿達峰濃度Cmax為2.702 μg/mL，吸收半衰期和消除半衰期分別為0.25 h和5.26 h，AUC為17.39 μg/mL·h，這說明恩諾沙星制成懸乳劑后具有一定的緩釋作用，肌注后藥物從血中消除的速率（0.611 h）明顯慢于普通注射劑[17-19]，而且肌注24 h后血漿藥物濃度（0.118～0.851 μg/mL）明顯高于最低抑菌濃度0.08～0.75μg/mL[20-21]，血藥濃度維持時間也長達60 h以上。

4 結論

本試驗研究結果表明，恩諾沙星懸乳劑在雞體內的藥代動力學特征優(yōu)良，血藥濃度維持時間也較長，可減少臨床用藥次數。此外，由于恩諾沙星懸乳劑工廠化生產工藝比較簡單，制作成本相對低，非常容易實現(xiàn)產業(yè)化生產。因此，恩諾沙星懸乳劑是一種具有廣泛開發(fā)和應用前景的獸醫(yī)臨床可用的新型抗菌藥劑。

參考文獻：

[1] 張航俊，周芷錦，侯軒，等.恩諾沙星、氟苯尼考和泰萬菌素在雞蛋中殘留消除規(guī)律研究[J].食品安全質量檢測學報，2021，12（19）：7851-7856.

[2] 趙琳，張瑞英，孫向東，等.產前飼喂模式下恩諾沙星在初產蛋中的殘留規(guī)律及膳食暴露評估[J].食品安全質量檢測學報，2021，12（18）：7473-7479.

[3] 單祥保，方龍香，施羽露，等.利用多介質環(huán)境逸度模型比較典型抗生素磺胺甲噁唑和恩諾沙星在水產養(yǎng)殖中的環(huán)境歸趨[J].生態(tài)與農村環(huán)境學報，2021，37（08）：1059-1065.

[4] 朱曉漫，劉永濤，楊秋紅，等.恩諾沙星乳在羅非魚體內的藥代動力學及組織分布[J].淡水漁業(yè)，2021，51（04）：42-48.

[5] 戴燕彬.恩諾沙星及其代謝產物在珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂）體內的代謝及消除規(guī)律[J].漁業(yè)研究，2021，43（03）：299-306.

[6] 王美紅. 恩諾沙星可溶性粉混飲給藥在雛雞的藥動學特征[D].揚州：揚州大學，2021.

[7] 張佩，劉雪松，姜巖，等.恩諾沙星在比格犬體內的藥代動力學研究[J].動物醫(yī)學進展，2020，41（12）：132-136.

[8] 許穎，邱陽陽，沈悅，等.恩諾沙星納米乳的制備及噴霧給藥的藥效學評價[J].華南農業(yè)大學學報，2021，42（01）：42-48.

[9] 唐敏敏，朱磊，欒楓婷，等.恩諾沙星在雪山雞不同組織中殘留消除規(guī)律研究[J].江蘇農業(yè)科學，2020，48（21）：215-219.

[10] 侯軒，周煒，陳勇，等.HPLC-MS/MS法研究恩諾沙星在雞蛋中殘留消除規(guī)律[J].畜牧與飼料科學，2020，41（05）：46-51.

[11] 黃銖玉，方龍香，宋超，等.抗生素恩諾沙星在漁業(yè)中的研究進展[J].農學學報，2019，9（11）：57-62.

[12] 杜昕悅，楊哲敏，趙宇，等.恩諾沙星與其他氟喹諾酮類藥聯(lián)合對畜禽常見病原菌抑菌效果探討[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（20）：140-143.

[13] 王玉萬，潘貞德，戴曉曦.含阿維菌素類抗寄生蟲藥物的長效注射劑：中國，ZlL031568769[P]. 2006-05-22.

[14] 肖田安，尹燁華，梁眷衡，等.恩諾沙星長效注射液肌注后在豬體內的藥動學研究[J].中國獸藥雜志，2002（04）：21-23.

[15] 肖田安，陳杖榴.氟喹諾酮類藥物在動物體內的藥動學研究進展[J].中國獸藥雜志，2000（01）：59-61.

[16] 孫紅洋，白玉惠，尹暉，等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測雞蛋和雞組織中恩諾沙星、環(huán)丙沙星殘留的研究[J].中國家禽，2020，42（07）：54-58.

[17] 王旗，余永濤，馬春芳，等.恩諾沙星可溶性粉中有效成分含量的HPLC測定[J].動物醫(yī)學進展，2020，41（09）：41-45.

[18] 邱陽陽.禽用恩諾沙星納米乳的制備及藥效學評估[D].廣州華南農業(yè)大學，2019.

[19] 劉婉玉，Tadiyose G B，趙洪霞.恩諾沙星在鯽魚肝微粒體中的代謝及代謝關鍵酶[J].生態(tài)毒理學報，2020，15（03）：64-70.

[20] 羅晶晶，張秀珍，宋懌，等.不同水溫條件下恩諾沙星及其代謝物在俄羅斯鱘體內的代謝及消除規(guī)律[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（06）：1749-1757.

[21] 鄭育基，全家興，霍皓遠，等.恩諾沙星及其代謝物在1日齡雞體內的藥動學研究[J].動物醫(yī)學進展，2019，40（11）：59-62.