丁恩慈 郭建華 沈婕

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種逐漸進展的動脈炎性疾病。隨著世界人口老齡化及風險因素暴露時間延長，AS 易損斑塊的破裂和繼發(fā)血栓導致卒中的風險增加[1]。分子成像可以在疾病臨床癥狀出現(xiàn)之前便提供相關的病理生理學信息，使得準確測定斑塊的組成成分并識別易損和高風險斑塊成為可能[2]。PET/CT 可同時了解斑塊的狹窄程度及斑塊的代謝情況，能夠無創(chuàng)性評價斑塊性質(zhì)，利用其顯像劑在人體內(nèi)AS 斑塊區(qū)特異性或非特異性聚集，使得冠狀動脈許多早期隱匿性病變（如炎性病變、早期微鈣化灶等）得到顯示[3-4]。

目前，氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）、氟化鈉（18FNaF）、68Ga-奧曲肽（68Ga-DOTATATE，簡寫為68Ga-DOTA）等已經(jīng)用于AS 斑塊的研究。18F-FDG 廣泛用于活體炎癥細胞的識別，18F-NaF 在體內(nèi)AS 斑塊的鈣化中特異性聚集[5]，68Ga-DOTA PET/CT 對非鈣化斑塊和點狀斑塊等高風險冠狀動脈病變有良好的診斷準確性[6]。但國內(nèi)外尚無將這3 種顯像劑同時用于動物的研究。本研究擬采用3 種顯像劑的PET/CT 對不同月齡ApoE 基因敲除小鼠的AS 易損斑塊顯像，探討3 種顯像劑檢測易損斑塊的可行性及臨床應用價值，并篩選出對易損斑塊最有價值的顯像劑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 高脂組為雄性ApoE 基因敲除小鼠18 只，8 周齡，體質(zhì)量（19±2）g，全程喂養(yǎng)高脂飼料（膽固醇1%、蛋黃粉10%、豬油10%、豬膽鹽0.35%、基礎飼料78.65%）。喂養(yǎng)17 周、23 周時各死亡1 只，及時補充同類型同月齡小鼠。對照組為雄性C57BL/6 普通小鼠18 只，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，全程喂養(yǎng)普通飼料。所有小鼠及飼料均購自天津放射醫(yī)學研究所動物中心[實驗動物使用許可證：SYXK（津）2019-0002]。記錄飼養(yǎng)前后全部小鼠的體質(zhì)量、血脂（游離脂肪酸、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）水平。動物實驗經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 小鼠分組 高脂組和對照組均采用隨機數(shù)字表法分別均分為2 組，即高脂1 組、高脂2 組、對照1 組、對照2 組，每組9 只。高脂1 組及對照1 組于喂養(yǎng)18 周時行PET/CT 檢查，高脂2 組及對照2 組于27 周時行PET/CT 檢查。4 組小鼠各自隨機分成3 個小組，每組3 只，分別給予3 種顯像劑（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）進行檢查。

1.3 PET/CT 成像 采用美國GE 公司的Explorer Vista micro-PET/CT 設備及圖像后處理系統(tǒng)。顯像劑（18F-FDG、18F-NaF、68Ga-DOTA）由解放軍總醫(yī)院（301 醫(yī)院）PET-CT 中心提供，放化純度≥95%。所有小鼠禁食6 h 后經(jīng)尾靜脈注射18F-FDG（或18F-NaF、68Ga-DOTA）(劑量均為1.0 mCi/kg)，60 min 后吸入異氟烷麻醉，將小鼠仰臥位固定于塑料板上以盡可能減少移動，隨后進行PET/CT 掃描。CT 掃描參數(shù)：管電壓50 kV，管電流200 μA，曝光時間200 ms，掃描范圍自小鼠頭部至尾部；PET 進行三維采集，采集時間共15 min，PET 影像采用CT 衰減校正和濾過反投影算法進行影像重建。顯像結束后處死小鼠，從升主動脈向下剖離至腹主動脈髂血管分叉處，進行離體腹主動脈PET/CT 成像。

1.4 影像分析 由2 位核醫(yī)學科5 年以上經(jīng)驗的主治醫(yī)師分別對各組小鼠的PET/CT 影像進行測量和分析，最后取2 位醫(yī)師測量值的平均值，意見不一致時商討確定。觀察及測量內(nèi)容：①記錄腹主動脈長度，在PET 及CT 上綜合確定AS 斑塊區(qū)，記錄斑塊數(shù)量并測量每只小鼠腹主動脈的最大斑塊長度。在CT 上測量斑塊的平均CT 值，注意避開周圍脂肪組織。②在PET 上測量斑塊的標準化攝取值（standard uptake value，SUV）并記錄最大值（SUVmax）及平均值（SUVmean）。分別計算不同顯像劑的最大和平均斑塊靶本比值（target-to-background ratio，TBR），即TBR-SUVmax及TBR-SUVmean；計算公式為TBR=SUV斑塊/SUV本底，其中SUV 本底為腹主動脈無攝取區(qū)域的SUV 值，SUV斑塊以SUVmax高于本底20%的病灶作為陽性斑塊，測量其SUV 值。

1.5 病理分析 根據(jù)Naghavi 等[7]歸納的病理學標準，有以下病理學特征之一即可視為AS 易損斑塊：①斑塊脂質(zhì)核心增大伴纖維帽變薄、巨噬細胞浸潤、有破裂傾向；②亞阻塞血栓形成伴早期機化的破裂斑塊；③含蛋白糖基質(zhì)平滑肌細胞豐富的侵蝕傾向斑塊；④亞阻塞血栓形成的侵蝕斑塊；⑤斑塊內(nèi)出血；⑥浸潤血管壁的鈣化結節(jié)；⑦慢性狹窄性斑塊伴嚴重鈣化、陳舊性血栓形成及管腔向心性狹窄。對4 組小鼠的離體腹主動脈進行病理分析，記錄每只小鼠腹主動脈易損斑塊數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗評估計量資料分布的正態(tài)性，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，2 組間比較采用獨立樣本t 檢驗；3組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 組小鼠離體血管的病理結果 高脂1 組、高脂2 組的腹主動脈分別有易損斑塊35、38 處，對照1 組、對照2 組分別有易損斑塊6、8 個。高脂組病理主要表現(xiàn)為動脈內(nèi)壁表面多量膠原纖維構成的纖維帽，其內(nèi)多發(fā)泡沫細胞和膽固醇結晶，局部炎癥細胞浸潤；免疫組化顯示泡沫細胞陽性（圖1）。對照組則血管較平滑，斑塊偶發(fā)。

圖1 高脂組小鼠腹主動脈病理及免疫組化圖。A 圖為HE 染色（×200）。B 圖為天狼猩紅染色（×200），示腹主動脈不同纖維被染成不同顏色。C 圖為免疫組化圖。

2.2 高脂組與對照組小鼠離體血管基本情況比較 高脂1 組及對照1 組在PET/CT 上分別發(fā)現(xiàn)32、5 處斑塊，高脂2 組及對照2 組分別發(fā)現(xiàn)34、6處斑塊。高脂組及對照組間血管長度差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高脂組的最大斑塊長度均高于對照組（P＜0.05）。高脂2 組血管斑塊的平均CT 值高于對照2 組（P＜0.05），高脂1 組與對照1 組的斑塊平均CT 值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 高脂組（1 組、2 組）和對照組（1 組、2 組）小鼠離體血管的基本情況比較

2.3 不同顯像劑在不同月齡高脂組間的顯像結果比較18F-FDG 和18F-NaF 顯像后，斑塊區(qū)血管壁的CT 密度不均勻，PET 和PET/CT 影像上均可見多發(fā)異常放射性濃集（圖2、3）。68Ga-DOTA 顯像后，斑塊區(qū)血管壁CT 密度不均勻，但PET 和PET/CT 影像上未見異常放射性濃集。

2.3.118F-FDG PET/CT 高脂1 組及2 組分別發(fā)現(xiàn)12、13 處斑塊。高脂2 組的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂1 組（P＜0.05），而高脂1 組的TBR-SUVmax和TBR-SUVmean均高于高脂2 組（P＜0.05）。2 組間18F-FDG 的SUVmax、SUVmean差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。PET/CT 顯像如圖2 所示。

表2 2 個高脂組間斑塊18F-FDG PET/CT 代謝參數(shù)比較

圖2 高脂組小鼠離體腹主動脈斑塊18F-FDG PET/CT 影像。由上到下每行分別為CT、PET 和PET/CT 融合圖影像，從左到右分別為血管的橫斷面、矢狀面、冠狀面影像。

2.3.218F-NaF PET/CT 高脂1 組及2 組分別發(fā)現(xiàn)11、12 處斑塊。2 組間代謝參數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），詳見表3。

表3 2 個高脂組間斑塊18F-NaF PET/CT 代謝參數(shù)比較

2.3.368Ga-DOTA PET/CT 高脂1 組及2 組的68Ga-DOTA PET/CT 上分別發(fā)現(xiàn)9 處斑塊。高脂1 組的本底SUVmax及SUVmean均高于高脂2 組（P＜0.05），其他代謝參數(shù)的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。詳見表4。

表4 2 個高脂組間斑塊18Ga-DOTA PET/CT 代謝參數(shù)比較

2.4 高脂組小鼠3 種顯像劑間PET/CT 代謝參數(shù)比較 高脂1 組和高脂2 組中，18F-FDG 、18F-NaF 和68Ga-DOTA PET/CT 的SUVmax（F1組=214.424，F(xiàn)2組=165.846）、SUVmean（F1組=107.590，F(xiàn)2組=80.581）、本底SUVmax（F1組=48.356，F(xiàn)2組=53.926）及本底SUVmean（F1組=48.356，F(xiàn)2組=34.442）的差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.001），其中18F-NaF 的上述參數(shù)均高于18FFDG 顯像，18F-FDG 及18F-NaF 均高于68Ga-DOTA（均P＜0.05）；而3 種顯像劑間TBR-SUVmax（F1組=50.798，P=0.239；F2組=52.921，P=0.478）、TBR-SUVmean（F1組=55.418，P=0.130；F2組=57.897，P=0.275）的差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

易損斑塊的早期識別是疾病預防的基礎，已成為心血管病診斷及預防的重要手段[8]。近年來核素分子顯像已經(jīng)用于易損斑塊識別及療效的監(jiān)測，多模態(tài)分子影像平臺（如PET/CT、PET/MR、MR/CT）診斷動脈易損斑塊不僅可以顯示斑塊的位置、大小及形態(tài)，還可以檢測斑塊的組成成分，評估斑塊的穩(wěn)定性和易損程度[9-10]。本研究將18F-FDG、18F-NaF 及68Ga-DOTA 這3 種顯像劑用于不同月齡的AS 模型小鼠和對照組，分析其檢測AS 易損斑塊的可行性及臨床應用價值。

圖3 高脂組小鼠離體腹主動脈斑塊18F-NaF PET/CT 影像。由上到下每行分別為CT、PET 和PET/CT 融合圖影像，從左到右分別為血管的橫斷面、矢狀面、冠狀面影像。

3.1 PET/CT 在AS 小鼠模型易損斑塊中的應用 本研究主要對高脂組及對照組小鼠離體腹主動脈進行了3 種顯像劑的PET/CT 顯像，同月齡小鼠高脂組的病變數(shù)量、長度均較對照組明顯增加，CT 值也更高，而高月齡組（高脂2 組）小鼠離體血管的斑塊病灶數(shù)量及最大病變長度均較低月齡組（高脂1 組）增加，說明ApoE 基因敲除小鼠配合高脂飼養(yǎng)可以成功獲得AS 小鼠模型。這類動物模型與人類血管的內(nèi)膜鈣化情況相似，動脈硬化早期會產(chǎn)生微鈣化，易損斑塊中可檢測到微鈣化和大鈣化[11]，18F-NaF 在活動性微鈣化中聚集的特點使18F-NaF PET/CT 顯像成為可能。王等[12]研究發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠主動脈對18F-FDG 的攝取值明顯高于對照組C57BL/6N 小鼠，并在血管離體顯像中發(fā)現(xiàn)顯像斑塊內(nèi)巨噬細胞數(shù)量明顯高于未顯像的斑塊，說明18F-FDG 的攝取能反映斑塊的炎癥程度，進一步識別易損斑塊。生長抑素受體結合物68Ga-DOTA，可以特異性結合在人類巨噬細胞處特異性表達的生長抑素受體2。國外有研究[13]報道ApoE 基因敲除小鼠模型中發(fā)現(xiàn)68Ga-DOTA 在巨噬細胞聚集處攝取明顯增高。

3.218F-FDG 用于AS 斑塊的價值18F-FDG 是目前比較實用的用于動脈硬化斑塊PET 顯像研究的顯像劑，已經(jīng)成功用于主動脈和頸動脈的斑塊顯像。18F-FDG 在炎癥區(qū)積聚的特點已經(jīng)被用來量化AS 中積累的炎癥細胞[14]。其中，易損斑塊中的巨噬細胞是促使冠心病向不良心血管事件不斷進展的因素，其數(shù)量與SUV 值高度相關[15]；SUVmax可間接反映AS 易損斑塊的炎癥程度和穩(wěn)定性。趙等[16]采用18F-FDG PET/CTA 成像檢測兔主動脈易損斑塊，發(fā)現(xiàn)在斑塊破裂誘發(fā)實驗之前，易損斑塊FDG 攝取值明顯高于穩(wěn)定斑塊；誘發(fā)實驗后，有血栓形成的動脈段的FDG 攝取值明顯高于無血栓形成的動脈段。本研究對小鼠進行18F-FDG 顯像發(fā)現(xiàn)，高脂組腹主動脈斑塊區(qū)存在放射性異常濃集，相應部位血管壁的CT 密度不均勻，故證實18F-FDG PET/CT 對于斑塊識別具有較高的特異性。但18F-FDG 用于冠狀動脈活體易損斑塊的特異性并不強，主要因為心肌細胞對其的大量攝取在一定程度上會抑制較細血管對其攝取。通過禁食、降低血糖等方法可以有效降低心肌細胞對18F-FDG 的攝取，未來有望用于臨床。

3.318F-NaF 用于鑒別AS 斑塊有重要的價值 AS斑塊的鈣化是一種與新骨形成極為相似的受調(diào)控的主動性代謝過程，其鈣鹽的主要成分是羥磷灰鈣，18F-NaF 通過替換羥基參于羥磷灰鈣的代謝，在血管早期鈣化及微鈣化中濃集[17]。使用18F-NaF micro-PET/CT 即可在臨床前研究中檢測微鈣化，具有較高的敏感性和特異性[18]。陳等[19]通過兔AS 模型活體顯像研究提出，18F-NaF 較18F-FDG 能夠更準確地用于檢測微鈣化及易損斑塊。本研究發(fā)現(xiàn)18FNaF 顯像的SUVmax值要高于18F-FDG，更容易識別斑塊，但18F-NaF 顯像對小鼠18 周及27 周時的代謝參數(shù)的差異無明顯統(tǒng)計學意義，說明其在早期及中晚期斑塊的辨認上可能有同等價值。McKenney Drake等[3]發(fā)現(xiàn)，相比18F-FDG，18F-NaF 放射性活性與疾病的臨床和病理有更高的相關性。18F-NaF 攝取標志著中早期不穩(wěn)定斑塊中微鈣化灶的存在，其攝取率與心血管疾病的發(fā)生風險呈正相關[20]。因此，18F-NaF 用于AS 病人可以提前鑒別易損斑塊，有利于有效且針對性地治療。

3.468Ga 標記的示蹤劑用于AS 斑塊的價值68Ga標記的示蹤劑可用于AS 斑塊成像，如68Gapentixafor 已用于冠狀動脈等小血管成像[21-22]。68Ga-DOTA 在近年來也受到廣泛關注，其對生長抑素受體2 有高度的親和性和選擇性，在巨噬細胞聚集處攝取明顯增高，且具有TBR 較高、不易被心肌細胞攝取等特點，有可能成為未來評估不穩(wěn)定斑塊炎癥活性良好的示蹤劑，較18F-FDG 更適用于冠狀動脈成像[6]。但本研究中發(fā)現(xiàn)68Ga-DOTA 對AS 斑塊的檢出極低，在不同月齡高脂小鼠中幾乎無放射性濃集，可能是因為本研究中高脂組小鼠已經(jīng)是AS 中期及后期，巨噬細胞聚集不夠多，也可能是因為易損斑塊本身不攝取68Ga-DOTA，因此不建議68Ga-DOTA 用于AS，至于其他68Ga 標記的顯像劑有待進一步研究。

3.5 高脂小鼠中3 種顯像劑的PET/CT 影像分析 高脂組小鼠18F-FDG 和18F-NaF 顯像中斑塊表現(xiàn)出放射性異常濃集，68Ga-DOTA 組則無明顯放射性濃集，體現(xiàn)了前2 種顯像劑檢測AS 斑塊的可行性及臨床價值。同月齡小鼠離體血管18F-NaF 的斑塊SUVmax與SUVmean、本底SUVmax與SUVmean均高于18FFDG 組，說明18F-NaF 較18F-FDG 識別易損斑塊更加敏感；此外，18F-NaF 的心肌攝取較低，因而較18FFDG 更適用于冠狀動脈顯像。另外，本研究還比較了TBR 值，TBR 綜合考慮了斑塊及本底的攝取，可以去除本底的影響因素，是比較推薦使用的代謝參數(shù)。本研究中18F-NaF 和18F-FDG 的TBR 差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量較小有關，未來加大樣本量研究也許能獲得更可靠的結果。

3.6 局限性及展望 本研究局限性主要是小鼠實驗樣本量偏少，實驗組活體顯像陽性的小鼠數(shù)目偏少，對照組小鼠顯像陽性部位更少，因此沒有進行活體顯像分析；由于樣本量小，故未對3 種顯像劑在離體血管中的診斷效能進行分析，未來將加大樣本量進一步進行診斷效能的研究，并進一步將18FNaF 及18F-FDG 用于活體易損斑塊的研究，為AS易損斑塊的早期甄別提供更加可靠的無創(chuàng)性檢查手段。