裴宇盛，陳 晨，趙小燕，高 華，蔡 彤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

新型制劑及其所用的輔料(膽固醇、蛋黃卵磷脂、乙膠脂丙膠脂共聚物等)多不溶于水，需采用非水性溶劑溶解，如無水乙醇、二甲基亞砜等。但在進行內(nèi)毒素的檢測研究過程中，關(guān)鍵一步為供試品陽性對照(回收試驗)的制備，即向供試品中添加細菌內(nèi)毒素標準物質(zhì)。由于目前國內(nèi)外的細菌內(nèi)毒素標準品中均含有聚乙二醇和乳糖等水溶性賦形劑[1-3]，不能溶于非水溶性溶劑，尤其聚乙二醇具有一定表面活性，當遇到非水溶性溶劑時會在萃取、稀釋等過程中會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，最終使檢驗無法進行[4-6]。

因此，需制備一批專用的細菌內(nèi)毒素標準品，用于新型制劑及其輔料等非水溶性藥品的內(nèi)毒素檢測，即細菌內(nèi)毒素國家標準品(非水溶性樣品用)。

1 材料與方法

1.1 儀器Synergy HT型多功能酶標儀(美國Biotek公司)；Multireax型旋渦混合器(德國Heidolph)；WNE45型恒溫水浴(德國Memmert公司)；BET-72型內(nèi)毒素測定儀(天大天發(fā)科技有限公司)MultiFlo FX型多功能微孔板分液器(美國Biotek公司)。

1.2 試劑細菌內(nèi)毒素精品原料，購于SIGMA公司，批號：024M4019V，該批原料是使用酚水法從菌號為O111B4的大腸桿菌中提取制備得到，生物效價為4×109EU·g-1，由中國食品藥品檢定研究院分裝為1 mg/支。細菌內(nèi)毒素國家標準品，中國食品藥品檢定研究院，批號：150800-201601。細菌內(nèi)毒素檢查用水：購于湛江安度斯生物有限公司，貨號：W-050。鱟試劑：購于湛江安度斯生物有限公司；廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；湛江博康海洋生物有限公司；福州新北生化有限公司。

1.3 標準品候選品的凍干制備共制備2批標準品候選品。分別于2018年1月24日生產(chǎn)了1批候選品，編號為A；于2018年4月18日生產(chǎn)了1批候選品，編號為B。溶液配制的總體積及凍干分裝體積如Tab 1。

Tab 1 Preparation of standard solution and divide volume

具體操作：取細菌內(nèi)毒精品2支，用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，封口膜封口后在旋渦混合器上混勻15 min，然后用刻度吸管將精品溶液吸出，放入裝有200 mL滅菌蒸餾水的1 000 mL錐形瓶中，重復(fù)2次，在磁力攪拌器上混勻30 min。分別加入內(nèi)毒素檢查用水補至Tab 1中規(guī)定的體積，在4 ℃下混合攪拌2 h。然后將溶液灌裝于2 mL的安瓿中，每支裝量按Tab 1中的分裝體積制備。約2.5 h時結(jié)束，放入凍干機進行48 h凍干之后機器封口。

1.4 標準品的效價標定該標準品是用于非水溶性新型制劑的細菌內(nèi)毒素檢測，在檢測中使用的方法主要為凝膠法、動態(tài)濁度法和動態(tài)顯色法。故使用以上三種內(nèi)毒素檢查方法，以現(xiàn)行的細菌內(nèi)毒素國家標準品(150800-201601)為基準，采用組織協(xié)作標定的形式，對2批候選品進行效價的標定。候選品A預(yù)估效價為每支800 EU；候選品B預(yù)估效價為每支2 500 EU。參加本次協(xié)作標定的單位共13家，標定單位名稱及各單位所使用的方法詳見Tab 2。

Tab 2 Information of laboratories participating in collaborative calibration

1.4.1標定方法要求 標定具體方法參考《中國藥典》2015年版四部附錄1143細菌內(nèi)毒素檢查法。其中凝膠法標定數(shù)量為：每個協(xié)作單位提供候選品A、B各3支，共6支。要求使用2個批號的凝膠法鱟試劑，分別對6支候選品進行效價標定。其中動態(tài)濁度法或動態(tài)顯色法標定數(shù)量為：每個協(xié)作單位提供A、B批候選品各3支，共6支。要求使用1個批號的光度法鱟試劑，對6支候選品進行效價標定。

最終將標定結(jié)果匯總統(tǒng)計，在2批候選品中選擇3種方法標定結(jié)果間差異小且可信限率小的1批，作為新型制劑專用的細菌內(nèi)毒素國家標準品。

1.4.2協(xié)作標定結(jié)果統(tǒng)計與定值 因生物測定方法所得數(shù)據(jù)的對數(shù)值方為正態(tài)分布，故生物測定方法的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用其對數(shù)值進行計算。

2 結(jié)果

2.1 各單位標定結(jié)果匯總具體結(jié)果見Tab 3～8。

Tab 3 Results of Gel clot test of candidate A

Tab 4 Results of Gel clot test of candidate B

Tab 5 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate A

Tab 6 Results of kinetic turbidimetric assay of candidate B

2.2 標定結(jié)果匯總統(tǒng)計分析按照細菌內(nèi)毒素國家標準品的統(tǒng)計方法，經(jīng)匯總統(tǒng)計、分析計算，標定結(jié)果見Tab 9,10。

為檢驗每批候選品3種方法標定的結(jié)果間差異有無顯著性，是否能夠合并計算，使用方差分析對3種標定方法的結(jié)果進行統(tǒng)計分析，結(jié)果見表11。

經(jīng)檢驗，候選品B的3種方法的標定結(jié)果間差異均有顯著性，候選品A的3種方法的標定結(jié)果間差異無顯著性。

候選品B需使用卡方檢驗，對每種方法的權(quán)重進行校正，使用校正后的權(quán)重，對3種方法的結(jié)果進行加權(quán)平均，最終得到效價值和可信限率。候選品A可直接對3種方法的結(jié)果進行加權(quán)平均，得到效價值和可信限率。

2.3 效價定值按照細菌內(nèi)毒素國家標準品統(tǒng)計方法計算，結(jié)果顯示，候選品A的3種方法的標定結(jié)果間差異無顯著性，可信限率最小。最終選擇候選品A為細菌內(nèi)毒素國家標準品(非水溶性樣品用)，并根據(jù)國際上內(nèi)毒素標準品效價取整原則，將其效價定值為每支700 EU。

Tab 12 Potency and FL/%

2.4 標準品的均一性研究細菌內(nèi)毒素國家標準品(非水溶性樣品用)的使用方法為整支復(fù)溶后一次性使用。故符合瓶內(nèi)均勻性較好的前提，可以使用簡化法均勻性方差分析。方案為抽取12支樣品，使用動態(tài)濁度法對其中11瓶測量一次計算，計算其方差作為其組間方差S1；其余1支樣品重復(fù)測量4次，計算其方差作為組內(nèi)偏差S2。每次測量均為2個平行孔。詳見Tab 13。

Tab 13 Uniformity test results

2.5 非水溶性樣品檢測試驗大豆油(供注射用)在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，需要將細菌內(nèi)毒素預(yù)先添加到大豆油中，通過回收試驗檢測出已知添加量的細菌內(nèi)毒素，回收率結(jié)果應(yīng)在50%～200%之間，而其他細菌內(nèi)毒素國家標準品只能用水來復(fù)溶，復(fù)溶后添加到大豆油中會產(chǎn)生分層。若直接用大豆油溶解其他內(nèi)毒素國家標準品則會出現(xiàn)渾濁，影響進一步實驗。

使用本標準品進行試驗，用0.5 mL大豆油溶解標準品，混勻時間不少于15 min，再進行稀釋或者萃取等步驟，如采用加入等體積細菌內(nèi)毒素檢查用水，萃取15 min，靜止取水相進行檢測，其回收率在50%～200%，說明該萃取方法能將內(nèi)毒素提取。

3 討論

3.1 結(jié)果分析本次標定結(jié)果中，候選品B的RSD值非常高，最高達151.4%，表明支間差異很大。分析原因，是由于本標準品不能使用賦形劑造成的。在內(nèi)毒素標準品制備凍干的生產(chǎn)過程中，賦形劑不僅起到使標準品成形的支架作用，還可以幫助內(nèi)毒素在分裝前的水溶液中分散更均勻、在凍干過程中減少升華損失，以上作用均可降低標準品凍干后的支間差異。但本標準品不能使用賦形劑，對分裝、凍干工藝的要求比其他標準品高。從標定數(shù)據(jù)也可以看出，候選品A的RSD比候選品B小很多，說明其產(chǎn)品的支間差異較小，生產(chǎn)工藝的精度更好。

雖然無賦形劑的標準物質(zhì)與有賦形劑標準物質(zhì)比較，支間差異略大，但其可信區(qū)間在內(nèi)毒素檢測的可接受范圍內(nèi)(50%～200%)，不會影響到內(nèi)毒素檢測的準確性。

3.2 應(yīng)用性此批標準品不僅可用于新型制劑及其輔料的內(nèi)毒素檢測，其他非水溶性藥品均可使用該標準物質(zhì)制備供試品的陽性對照和內(nèi)毒素的檢測。故命名其為“細菌內(nèi)毒素國家標準品(非水溶性樣品用)”。為了避免與現(xiàn)有細菌內(nèi)毒素國家標準品出現(xiàn)結(jié)果沖突，該標準品作為現(xiàn)有國家標準品在特殊情況無法使用時的補充。

以膽固醇(供注射用)為例：膽固醇在建立細菌內(nèi)毒素檢查方法時，無法將內(nèi)毒素標準品直接添加到膽固醇中，需要用乙醇溶解膽固醇，用水溶解內(nèi)毒素標準品，需要預(yù)先摸索合適的微量高濃度內(nèi)毒素添加到膽固醇的乙醇溶液中，否則膽固醇或者乳糖會析出體系。使用本標準品進行試驗，用膽固醇乙醇溶液直接溶解標準品，則直接完成了供試品陽性對照。