袁 丁，羅芙嬌，王 婷，周志勇，何毓敏，劉朝奇，張長城，袁成福

(1.三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002；2.武漢科技大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430081)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種全球性流行病，它可能從獨立的脂肪變性發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化，并最終發(fā)展為肝癌。在我國，NASH是慢性重癥肝病的主要誘因，也是肝移植的主要原因之一。因此，探索NASH的發(fā)生發(fā)展機制，并有針對性的建立行之有效的防治策略，具有極其重要的科學研究意義和臨床應用前景。

微小核糖核酸(miRNAs)是一類由18～25個核苷酸組成的的非編碼核糖核酸，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達[1]。去乙酰化酶1(Sirtuin1，SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶。有研究表明SIRT1能與線粒體融合蛋白2(mitofusin-2，MFN2)相互作用，MFN2是SIRT1的底物[4]。而肝組織中MFN2表達的減少導致活性氧生成的增加和三磷酸腺苷合成的減少，從而增加氧化應激和炎癥反應[2]，MFN2敲除小鼠的血漿及肝臟中促炎因子的豐度明顯增加[3]。

竹節(jié)參(Panacisjaponicirhizoma)又名竹節(jié)人參、竹節(jié)三七，兼具人參和三七雙重藥效，為五加科植物竹節(jié)參(Panaxjaponicus.C.A.Mey.)的根狀莖及肉質(zhì)塊根，是我國民間常用中草藥[4]。有研究發(fā)現(xiàn),竹節(jié)參總皂苷(total saponins ofPanaxjaponicas，TSPJ)可明顯可明顯改善由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和自噬介導的自然衰老大鼠肝臟的炎癥反應[5]，也可明顯改善惡病質(zhì)腫瘤小鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平[6]。因此，本研究將建立高脂飲食(high fat diet,HFD)小鼠模型，研究相關(guān)信號通路并探討TSPJ在NASH發(fā)生發(fā)展過程中對小鼠肝細胞保護作用的分子機制，為臨床應用竹節(jié)參防治NASH提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物本實驗所用竹節(jié)參根塊采集于湖北省恩施市椿木營竹節(jié)參種植基地，由三峽大學醫(yī)學院何毓敏博士團隊進行分離與鑒定，并采用優(yōu)化提取工藝，以竹節(jié)參干燥的粗粉為原材料進行了提取與分離，提取率達到18.4%，純度達到83.48%，可以滿足后續(xù)實驗要求。

1.2 試驗動物SPF級BALB/c ♂小鼠45只，由湖北省宜昌市三峽大學實驗動物中心提供，其動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2017-0012。

1.3 試劑高脂飼料購自于華阜康公司(編號：H10060)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYER GREEN均購買于諾唯贊生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購于大連寶生物科技有限公司；PCR引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司；兔單抗anti-SIRT1(millipore,#07-131)、兔單抗β-Actin(Servicebio)(GB11001)、兔單抗Mitofusion-2(NIAR164,ab124773)、兔多抗IL-1β(ab9722)、鼠單抗TNF-α(santacruz,SC-52746)購于上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；總蛋白提取裂解液、BCA工作液均購買于武漢科瑞有限公司；ECL顯影液購于武漢生物科技公司。

1.4 主要儀器儀器實時定量PCR儀來自德國Applied Biosysterms公司；PowerPasBasic200電泳儀購于美國Bio-Rad公司；BioshineChemiQ4800mini化學發(fā)光凝膠成像顯影設(shè)備購于上海歐翔科學儀器有限公司；IX53顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.5 實驗方法

1.5.1小鼠脂高脂誘導模型的建立 45只Balb/c小鼠隨機分為正常組(Control組)、高脂飲食組(HFD組)、TSPJ低劑量組(15 mg·kg-1)、TSPJ高劑量組(45 mg·kg-1)，正常組給予普通維持飼料，HFD組、SPJ低、高劑量組給予高脂飼料。TSPJ低、高劑量組小鼠每天灌胃給予15 mg·kg-1，45 mg·kg-1的TSPJ(溶于生理鹽水)，其他組每天灌胃等量的生理鹽水。持續(xù)7個月后處死小鼠，進行血清收集及肝臟取材。

1.5.2肝組織HE染色 切取大小為10 mm ×3 mm的新鮮肝臟大葉組織塊放入組織包埋盒中，置于中性福爾馬林固定液中固定48 h，再轉(zhuǎn)入75%乙醇中，8 h后再經(jīng)過常規(guī)脫水處理，石蠟進行包埋，然后再將蠟塊切片為厚度4 μm的組織切片，固定于防脫載玻片上，進行常規(guī)HE染色，普通顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況。

1.5.3實時熒光定量PCR檢測MFN2、SIRT1、TNF-α、IL-1β、miR-199的表達 稱取小鼠肝組織50 mg，采用試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA。用核酸儀測定RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得cDNA；miR-199用莖環(huán)引物進行逆轉(zhuǎn)錄(5′-GTCGTATCCAGTGCAG GGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAACAGGT AGTC-3′)。MFN2、SIRT1、TNF-α、IL-1β、SREBP、ChREBP以GAPDH為內(nèi)參，miR-199以U6為內(nèi)參，經(jīng)過PCR反應擴增目的基因。RT-PCR反應體系為10 μL體系，分別為RNase-freewater 2.6 μL，SYBER GREEN 5 μL，引物0.4 μL，cDNA 2 μL。RT-PCR實驗反應條件：95 ℃、5 min；95 ℃、10 s；60 ℃、30 s；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min，95 ℃、15 s；cycles 40；溶解曲線從56 ℃到98 ℃，每0.3 ℃讀取一次；PCR反應結(jié)束后讀取CT值，計算2-ΔΔCt并分析目的基因在各個樣本中的表達情況。

1.5.4Western blot檢測小鼠肝組織MFN2、SIRT1、TNF-α、IL-1β蛋白的表達 稱取凍存肝臟組織50 mg，加入預冷的PBS洗滌組織，以RIPA ∶PMSF ∶蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1的體積比配制裂解液。每管加入500 μL的裂解液，應用電動勻漿器進行組織勻漿，冰浴裂解15 min，再經(jīng)4 ℃，12 000 r· min-1，離心10 min后取上清分裝。用BCA蛋白濃度試劑盒測定所提取的蛋白濃度；加入5× loading buffer混勻后，沸水(100 ℃)煮10 min使之變性；在10% SDS-PAGE凝膠進行電泳，然后將蛋白電轉(zhuǎn)印至NC膜上。用5%脫脂牛奶室溫下封閉NC膜1 h，在4 ℃孵育一抗(抗體比例為1 ∶3 000)過夜；洗膜后再加對應來源的二抗(抗體比例為1 ∶4 000)，在室溫下孵育1 h，洗膜后用進行顯影；利用ImageJ軟件對所得的條帶進行分析。

1.5.5免疫熒光檢測MFN2、SIRT1的定位及表達情況 石蠟切片60 ℃烤片4 h以上，依次將石蠟切片放入二甲苯10 min，無水乙醇5 min，95%乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，50%乙醇5 min，ddH2O洗5 min，微波修復，PBS沖洗3次，5% BSA 37 ℃封閉1 h，一抗4 ℃孵育于濕盒中過夜。PBS沖洗3次，每次5 min，室溫下二抗避光孵育1 h，切片甩干后在滴加DAPI染液，避光孵育3～5 min。玻片用PBS洗滌3次，每次5 min。滴加適量防熒光淬滅劑，用樹脂封片劑封片。

1.6 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)采用用Graphpad軟件進行分析，利用單因素方差分析組間數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色評分并觀察肝組織病理變化根據(jù)Nash Clinical Research Network Scoring Systems，對NASH進行評分，評分為6分，提示NASH模型成立。Fig 1染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝細胞排列規(guī)則而緊密，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝組織結(jié)構(gòu)未見病理性改變，HFD組小鼠肝組織中炎性細胞浸潤明顯，且伴有大量脂滴，細胞排列松散而不規(guī)則，肝細胞出現(xiàn)氣球樣變。與模型組相比較，TSPJ低劑量組和高劑量組的肝細胞排列較為緊密，脂肪空泡、肝細胞氣球樣變及炎性浸潤情況有明顯改善。

Fig 1 HE staining of liver tissues in each group(200×)

2.2 實時熒光定量PCR檢測ChREBP、SREBP的mRNA表達量如Fig 2顯示，與正常組相比，HFD組中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol-regulatory element binding proteins，SREBP)、碳水化合物反應元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element binding protein，ChREBP)、IL-1β及TNF-α的mRNA表達水明顯升高，MFN2、SIRT1的mRNA表達明顯降低，提示小鼠出現(xiàn)肝臟脂肪代謝異常，并出現(xiàn)炎癥反應。當給予TSPJ干預后，ChREBP、SREBP、IL-1β及TNF-α的mRNA表達水平明顯下降，SIRT1及MFN2的mRNA表達明顯升高，提示TSPJ可以通過下調(diào)ChREBP、SREBP、IL-1β及TNF-α的表達來緩解NASH造成的脂肪代謝異常及炎癥反應。

Fig 2 Lipogenic genes and inflammation genes regulated by TSPJ through SIRT1/

2.3 Western blot檢測TNF-α、IL-1β、SIRT1及MFN2的表達如Fig 3顯示，與正常組相比，HFD組中IL-1β、TNF-α的蛋白的水平明顯升高，MFN2及SIRT1的蛋白水平明顯降低。當給予TSPJ干預后，IL-1β及TNF-α的蛋白表達水平明顯下降，MFN2及SIRT1的蛋白水平明顯升高，提示TSPJ可以通過下調(diào)TNF-α及IL-1β的表達來緩解NASH造成的炎癥反應，緩解NASH的發(fā)生發(fā)展。

Fig 3 The protein expression of inflammation genes regulated by TSPJ through SIRT1/ MFN2 pathway

2.4 免疫熒光檢測肝組織MFN2及SIRT1的表達情況結(jié)果顯示，對比正常組，HFD組肝組織的MFN2及SIRT1熒光強度降低。對比HFD組，TSPJ低劑量和高劑量組肝組織的MFN2及SIRT1熒光強度增加(Fig 4)。提示TSPJ可以通過上調(diào)SIRT1和MFN2的表達來緩解NASH的發(fā)生與發(fā)展。

Fig 4 Localization and expression of MFN2 and SIRT1 detected by immunofluorescence(200×)

2.5 miR-199與SIRT1靶向調(diào)節(jié)關(guān)系及TSPJ干預作用通過生物信息學驗證，預測SIRT1是miR-199的靶基因之一，miR-199能夠負調(diào)控SIRT1的表達。通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，HFD組miR-199表達明顯增高，與SIRT1檢測結(jié)果相比較，證實了其之間的負調(diào)控關(guān)系。同時給予TSPJ干預后，miR-199的表達明顯降低(Fig 5)。

Fig 5 The targeting relationship between miR-199 and SIRT1and mRNA expression #P<0.05 vs Control; *P<0.05 vs HFD

3 討論

MFN2是一種線粒體膜蛋白，能夠連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體，具有連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體的作用[7]。肝組織中MFN2表達的減少導致活性氧生成的增加和三磷酸腺苷合成的減少，從而增加氧化應激和破壞代謝[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟MFN2敲除小鼠的血漿及肝臟中促炎因子的豐度明顯增加[3]。敲除MFN2后，通過SIRT1介導的自噬和對缺血/再灌注損傷的細胞保護消失，提示MFN2是SIRT1的一個靶點[9]。SIRTI能與MFN2相互作用，MFN2是SIRT1的底物[4]。

SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性脫乙酰酶，在脂肪酸氧化過程中的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，SIRT1通過去乙?；{(diào)節(jié)肝臟能量代謝，SIRT1敲除小鼠肝臟脂肪變性增加，SIRT1過表達可保護高脂肪飲食誘導下的SIRT1轉(zhuǎn)基因小鼠免于肝臟脂肪變性、肝臟葡萄糖耐受不良或肝臟炎癥[11]。

現(xiàn)代藥理研究表明，竹節(jié)參具有良好的抗炎活性，在小鼠NASH模型中，TSPJ能夠通過干預MFN2從而調(diào)節(jié)NASH的發(fā)生與發(fā)展[12]。本研究采用BALB/c小鼠，高脂飲食誘導建立NASH模型，用藥組給予TSPJ干預。結(jié)果顯示，經(jīng)過TSPJ干預后，MFN2及SIRT1的mRNA，蛋白及免疫熒光表達水平明顯升高，IL-1β、TNF-α的mRNA及蛋白的表達明顯降低，ChREBP、SREBP的mRNA表達明顯降低。HE染色顯示TSPJ低、高劑量組的肝細胞排列較為緊密，脂肪空泡及炎性浸潤情況有明顯改善。

miRNAs是一類由18～25個核苷酸組成小的非編碼核糖核酸。在大多數(shù)情況下，miRNAs結(jié)合到靶基因的3′未翻譯區(qū)(UTR)，通過破壞miRNAs或沉默翻譯來抑制蛋白合成[1]。大量研究表明，在人類和動物的NAFLD和NASH模型中都發(fā)生了肝臟miRNAs譜的改變[13]，這提示miRNAs在NASH的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。例如，miR-122在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用[14]；miR-34a表達在NASH患者的肝臟和高脂飲食誘導的NASH動物模型中高度增加[8]；miR-199在NAFLD中呈現(xiàn)高表達[15]。有研究表明，生物信息學分析提示，miR-199靶向SIRT1基因[16]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TSPJ可抑制miR-199表達，促進SIRT1的表達，改善NASH的病理變化及炎癥反應。

以上結(jié)果提示，miR-199/SIRT1/MFN2信號通路能影響肝細胞的炎癥反應，并最終影響NASH發(fā)生發(fā)展的進程。TSPJ能過通過調(diào)節(jié)miR-199/SIRT1/MFN2信號通路改善肝細胞炎性反應，為治療NASH提供了新思路。