陽 創(chuàng)，熊寶萍，鄭雲(yún)丹，李斯曼，周上鈞，蔣青松

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶藥物代謝學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

長期慢性高血糖是糖尿病的主要特征。持續(xù)血糖水平升高破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能，是糖尿病血管病變最重要的病理基礎(chǔ)之一[1]。在內(nèi)皮細(xì)胞中，高血糖誘導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)，包括氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激，產(chǎn)生過量的活性氧和活性氮，使自由基清除平衡被破壞，從而引起DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的損傷?，F(xiàn)有研究表明，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可以改善血管內(nèi)皮損傷[2]，但對硝化應(yīng)激在糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用研究則相對較少。在病理過程中，過量活性氮物質(zhì)如過氧亞硝酸鹽(OONO-)的生成是硝化應(yīng)激反應(yīng)的重要特征，最終導(dǎo)致一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低。既往研究表明，活性氮物質(zhì)也可引起DNA損傷，損害內(nèi)皮細(xì)胞功能[3]。因此，硝化應(yīng)激在內(nèi)皮損傷中相關(guān)機(jī)制的研究對糖尿病血管并發(fā)癥的防治可能具有重要意義。過氧化物酶體增殖物激活受體β(peroxidase proliferator activated receptor，PPARβ)是核受體超家族成員之一，可能是預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的潛在靶標(biāo)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PPARβ 可以減輕氧化應(yīng)激，改善糖尿病小鼠的內(nèi)皮功能[5-6]。然而，目前國內(nèi)外尚未見PPARβ與硝化應(yīng)激在高糖引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷中關(guān)系的研究。

本研究擬利用高糖孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別給予PPARβ激動(dòng)劑GW0742、PPARβ拮抗劑GSK0660和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，初步觀察PPARβ與硝化應(yīng)激在高糖損傷內(nèi)皮功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 HUVECs(SWEXB11506)購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.1.2試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基(C11885500BT)購于美國Gibco公司；胎牛血清(SMK110.01)購于賽米克生物技術(shù)公司；BCA蛋白定量測定試劑盒(B09900190)購自北京鼎國昌盛生物公司；peroxynitrite assay試劑盒(ab233468)購自美國Abcam公司；EdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒(C0071)、NO檢測試劑盒(S0023)、L-NAME(S0006)、D-葡萄糖(D-glucose，ST1127)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GW0742(HY-13928)、GSK0660(HY-12377) 均購于美國MCE公司；eNOS小鼠單克隆抗體(SC-136977)、PPARβ小鼠單克隆抗體(SC-74517)購自美國Santa Cruz公司；CCK-8細(xì)胞活力及毒性檢測試劑盒(BA00208)、3-nitrotyrosine兔多克隆抗體(bs-8551R)購自博奧森生物科技公司；iNOS兔多克隆抗體(18985-1-AP)、GAPDH小鼠單克隆抗體(60004-1-Ig)購自武漢Proteintech公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(BL520A)購自北京Biosharp公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)；細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(安泰技術(shù)有限公司)；倒置熒光顯微鏡(Nikon)；低溫離心機(jī)(Thermo)；濕式轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；垂直電泳槽(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs細(xì)胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每48 h換液，待細(xì)胞生長達(dá)到80%～90%可進(jìn)行傳代，取第3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞活力檢測 將HUVECs細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組4個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后換為無血清的低糖DMEM同步化24 h，隨后以含葡萄糖30、40、50 mmol·L-1以及甘露醇30 mmol·L-1(滲透壓對照組)的培養(yǎng)液處理48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱孵育1 h后，在酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞在不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中同步化24 h后，給予相應(yīng)藥物干預(yù)48 h后檢測。分組如下：① 正常葡萄糖對照組(NG，glucose 5.5 mmol·L-1)；② 高葡萄糖組(HG，glucose 30 mmol·L-1)；③ 高糖+PPARβ激動(dòng)劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1)；④ 高糖+PPARβ激動(dòng)劑+PPARβ拮抗劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1+GSK0660 1 μmol·L-1)；⑤ 高糖+PPARβ激動(dòng)劑+NOS抑制劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1+L-NAME 10 μmol·L-1)。

1.2.4細(xì)胞增殖檢測 將細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組采用相應(yīng)藥物干預(yù)后，去除培養(yǎng)液，按照EdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書操作，將細(xì)胞與EdU染液于37 ℃孵育2 h，用4%多聚甲醛固定，使用Hoechst 33342進(jìn)行細(xì)胞核染色，采用熒光顯微鏡觀察結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞陽性染色百分率作為增殖率。

1.2.5Western blot檢測蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞，加入裂解液后冰上裂解30 min，14 000×g離心15 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入相應(yīng)抗體，即抗PPARβ(1 ∶500)，抗eNOS(1 ∶500)，抗3-nitrotyrosine(1 ∶500)，抗iNOS(1 ∶1 000)，抗GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，再次洗膜，通過ECL顯影，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.2.6OONO-水平檢測 將HUVEC以2×104個(gè)/孔接種于黑色透明底的96孔酶標(biāo)板中，過夜待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)Peroxynitrite Assay試劑盒操作說明，按照實(shí)驗(yàn)分組，加入90 μL相應(yīng)分組的培養(yǎng)液，與10 μL Peroxynitrite Sensor Green工作液共同在37 ℃孵育2 h后，在Ex/Em=490/530 nm處測量熒光強(qiáng)度，以相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU)代表OONO-的水平。

1.2.7NO含量檢測 將HUVEC以2×105個(gè)/孔接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)藥物干預(yù)48 h，取培養(yǎng)液上清，按試劑盒操作說明，加入Griess Reagent I，Griess Reagent Ⅱ混勻，于酶標(biāo)儀測定540 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO濃度。

2 結(jié)果

2.1 高糖對HUVECs細(xì)胞活力的影響如Fig 1所示，高濃度葡萄糖(30、40、50 mmol·L-1)使細(xì)胞活力明顯降低。與正常葡萄糖濃度(5.5 mmol·L-1)比較，分別降低至(79.95±2.36)%、(72.32±5.17)%和(65.05±3.60)% (P<0.01)。甘露醇(30 mmol·L-1)對細(xì)胞活力沒有明顯影響(P>0.05)。

Fig 1 Effect of glucose at different concentrations on cell viability of HUVECs

2.2 高糖對HUVECs細(xì)胞增殖的影響綜合文獻(xiàn)[7]及細(xì)胞活力結(jié)果，以葡萄糖30 mmol·L-1為高糖(HG)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Fig 2結(jié)果顯示，高糖處理明顯抑制HUVEC的增殖能力(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)可恢復(fù)被高糖損傷的HUVECs的增殖能力(P<0.01)。GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME(10 μmol·L-1)均可取消GW0742的作用(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG)on cell proliferation of HUVECs

2.3 高糖對PPARβ、eNOS、iNOS、3-nitrotyrosine蛋白表達(dá)的影響如Fig 3所示，高糖孵育使HUVECs的PPARβ及eNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，但iNOS和3-nitrotyrosine表達(dá)增加(P<0.05)。GW0742(1 μmol·L-1)可上調(diào)PPARβ及eNOS蛋白的表達(dá)(P<0.05)，并下調(diào)iNOS和3-nitrotyrosine蛋白的表達(dá)(P<0.05)。GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME (10 μmol·L-1)均可取消GW0742的作用(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on protein expression of PPARβ，eNOS，iNOS，and 3-nitrotyrosine )

2.4 高糖對OONO-水平的影響高糖刺激明顯使OONO-水平增加(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)明顯減少OONO-的水平(P<0.01)，且該作用可被GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME(10 μmol·L-1)阻斷(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on peroxynitrite (OONO-) level

2.5 高糖對NO含量的影響高糖孵育明顯降低HUVEC中NO的含量(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)可增加NO含量，GSK0660(1 μmol·L-1)或L-NAME(10 μmol·L-1)均可阻斷GW0742的作用(P<0.05)(Fig 5)。

Fig 5 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on

3 討論

糖尿病是一種累及微血管和大血管的多系統(tǒng)疾病，血管并發(fā)癥是Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者死亡的主要原因[8]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能是糖尿病血管并發(fā)癥最早的病理事件[9]。長期高血糖狀態(tài)引起內(nèi)皮功能障礙、血小板高反應(yīng)性、氧化應(yīng)激和慢性炎癥等病理變化，破壞血管壁[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨葡萄糖濃度增加(30、40、50 mmol·L-1)，HUVEC細(xì)胞活力呈劑量依賴性下降，提示高濃度葡萄糖可損傷內(nèi)皮細(xì)胞活性。同時(shí)，等滲透壓的甘露醇(30 mmol·L-1)對HUVEC細(xì)胞活力沒有影響，提示該損傷不是來自于滲透壓的改變。30～50 mmol·L-1的葡萄糖常被用于模擬糖尿病時(shí)機(jī)體的高血糖環(huán)境，以建立糖尿病離體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚7，10]。本實(shí)驗(yàn)條件下，30 mmol·L-1葡萄糖即明顯損傷HUVECs活力，故以30 mmol·L-1為高濃度葡萄糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究中，高糖作用也使HUVECs細(xì)胞增殖能力下降，提示高糖可能抑制HUVECs的增殖，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。大量臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，內(nèi)皮功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥中有重要作用[11-12]。因此，探索高糖狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞損傷的參與因素及相關(guān)調(diào)控機(jī)制對于預(yù)防或延緩糖尿病患者血管并發(fā)癥具有重要意義。

現(xiàn)有研究表明，PPARs參與了多種慢性疾病(如糖尿病、癌癥、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化)的發(fā)生、發(fā)展。PPARβ是PPARs的亞型之一，廣泛表達(dá)于全身各組織，在調(diào)節(jié)脂肪酸攝取、運(yùn)輸和 β-氧化以及胰島素分泌和敏感性方面均有重要意義[13]。PPARβ受體激活可以改善小鼠的內(nèi)皮功能障礙[14]。增加PPARβ表達(dá)和活性可保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HUVEC的凋亡[15]。這些研究顯示，PPARβ在維持血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能完整性方面可能也有重要作用。我們的結(jié)果顯示，高糖作用使PPARβ蛋白表達(dá)下調(diào)；PPARβ激動(dòng)劑GW0742上調(diào)PPARβ蛋白水平的同時(shí)，也改善高糖條件下HUVEC的細(xì)胞增殖能力；而PPARβ拮抗劑GSK0660可以取消GW0742的保護(hù)作用。上述結(jié)果提示，PPARβ可能參與了高糖對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的損傷作用。但PPARβ作用的相關(guān)分子機(jī)制，目前尚未完全清楚。

綜上所述，PPARβ參與了高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，該作用可能是由硝化應(yīng)激途徑介導(dǎo)的。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步闡明糖尿病血管并發(fā)癥相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制，為糖尿病血管病變的防治提供潛在的作用靶點(diǎn)。