彭婀敏，歐陽(yáng)錫武，王文龍，鄭璐，姚磊，白寧

（1.中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410078；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院2.國(guó)際醫(yī)療部3.普通外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

肝癌是世界上第2 位最常見(jiàn)惡性腫瘤[1-3]。在中國(guó)，其發(fā)病率及致死率分別位于第4 位及第2 位[4]。肝癌預(yù)后差，具有高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已處于晚期，并且5年生存率通常低于15%[5]。因此，進(jìn)一步探討肝癌的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)以提高肝癌的治療效果，是臨床醫(yī)生所面臨的重要問(wèn)題。

microRNA（miRNA）是大小為17～25 個(gè)核苷酸的短RNA 分子，可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)抑制靶基因的表達(dá)。單個(gè)miRNA 可以靶向數(shù)百個(gè)mRNA，并影響通常參與功能相互作用途徑的許多基因的表達(dá)。miRNA 已被證明與許多疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，并且參與眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等過(guò)程[6-12]。

腺苷酸環(huán)化酶1（adenylate cyclase 1，ADCY1）是ADCY 超家族的成員，其位于7p12.3，包含22 個(gè)外顯子；蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子量為130 kD。已有相關(guān)研究報(bào)道了ADCY1 在結(jié)腸癌[13]、黑色素瘤[14]、肺癌[15]、胰腺癌[16-17]等腫瘤中發(fā)揮重要作用，但尚未有研究報(bào)道其與肝癌發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移的聯(lián)系。

本研究通過(guò)篩選并分析相關(guān)測(cè)序數(shù)據(jù)，證實(shí)了miR-18a-3p 在肝癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并能通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制下游ADCY1 基因的表達(dá)來(lái)增加肝癌細(xì)胞的侵襲及生長(zhǎng)能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 本研究中所使用正常肝組織細(xì)胞L-02、肝癌細(xì)胞SK-HEP-1、HA22T 均來(lái)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。選取中南大學(xué)湘雅醫(yī)院普通外科30 例肝癌患者的癌組織及癌旁組織作為臨床標(biāo)本，患者入院時(shí)均簽署知情同意告知書。

1.1.2 主要試劑 TRIzol?Reagent、Lipofectamine?3000 試劑均購(gòu)自Invitrogen 公司（美國(guó)）；SYBR Green qPCR Mix、4×Reverse Transcription Master Mix均購(gòu)自TaKaRa 公司（美國(guó)）；8 μm Transwell 小室、6 孔盤、24 孔盤均購(gòu)于Corning 公司（美國(guó)）；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于Invitrogen 公司（美國(guó)），胎牛血清購(gòu)于Gibco 公司（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 正常肝細(xì)胞L-02 使用1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)、肝癌細(xì)胞SK-HEP-1、HA22T 使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-鏈霉素雙抗），并置于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 將基底膠按1∶20 比例稀釋后，每個(gè)transwell 小室加入100 μL，并置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中使其凝固。2 h 后，于上室加入150 μL 含100 000 個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入含血清培養(yǎng)基，再放入37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h。取出上室，進(jìn)行清洗、固定、染色、顯微鏡下觀察、拍照等。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)副孔。

1.2.3 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) TRIzol 試劑提取肝癌細(xì)胞總RNA，取2 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。 使用Bio-Rad CFX96 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 計(jì) 算RNA （mRNA 和miRNA） 的表達(dá)。GAPDH （用 于mRNA） 或U6（用于miRNA）標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，并通過(guò)ΔΔCt 值評(píng)估相對(duì)表達(dá)。 所有引物均購(gòu)自Integrated DNA Technologies 公司（美國(guó)）。

1.2.4 MTT 增殖實(shí)驗(yàn) 用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200 μL。培養(yǎng)3～5 d后，每孔MTT 溶液（5 mg/mL 用PBS 配）20 μL 繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm 波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 過(guò)表達(dá)miR-18a-3p 質(zhì)粒的構(gòu)建 過(guò)表達(dá)miR-520F-3p 采用pLV 慢病毒質(zhì)粒作為載體，序列（上游： CGC GTA CTG CCC TAA GTG CTC CTT CTG GGT CGA CCC AGA AGG AGC ACT TAG GGC AGT TTT TTG， 下 游： CGC AAA AAA CTG CCC TAA GTG CTC CTT CTG GGT CGA CCC AGA AGG AGC ACT TAG GGC AGT A） 由 Integrated DNA Technologies 公司（美國(guó)）提供。新構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)小提、酶切驗(yàn)證后再經(jīng)大提擴(kuò)增，然后經(jīng)慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后行下一步功能實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 miR-18a-3p 抑制劑質(zhì)粒構(gòu)建及瞬轉(zhuǎn) miR-18a-3p 抑制劑質(zhì)粒購(gòu)買于Integrated DNA Technologies 公司（美國(guó)），具體序列為rCrCrA rGrArA rGrGrA rGrCrA rCrUrU rArGrG rGrCrA rGrU。瞬轉(zhuǎn)具體步驟：⑴當(dāng)肝癌細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%匯合度時(shí)轉(zhuǎn)染，6 孔板：貼壁細(xì)胞0.25～1×106；⑵使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine?3000 試劑，充分混勻：無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基125 μL，Lipofectamine?3000試劑5 μL；⑶使用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基稀釋DNA，制備DNA 預(yù)混液，充分混勻：無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基125 μL，miR 抑制劑2.5 μg；⑷在每管已稀釋的Lipofectamine?3000 試劑中加入稀釋的miR 抑制劑（1∶1 比例）：稀釋的DNA 125 μL，稀釋的Lipofectamine?3000 試劑125 μL；⑸孵育：室溫孵育10～15 min；⑹加入DNA-脂質(zhì)復(fù)合物至細(xì)胞中：每孔miR 抑制劑-脂質(zhì)體復(fù)合物250 μL，miR 抑制劑2 500 ng，Lipofectamine?3000 試劑用量5 μL；⑺分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞37 ℃孵育細(xì)胞2～4 d，然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.2.7 ADCY1 的3'UTR 野生型和突變型質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)Targetscan 網(wǎng)站（https://www.targetscan.org/vert_71） 對(duì)ADCY1 3'UTR 序列分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ADCY1 3'UTR 共9 121 個(gè)堿基序列，為分析miR-18a-3p 對(duì)ADCY1 3'UTR 的調(diào)控功能，選取ADCY1 3'UTR 前2 200 個(gè)堿基序列構(gòu)建野生型及突變型質(zhì)粒。ADCY1 的3'UTR 采用psiCHECK-2 質(zhì)粒為載體。野生型引物序列（上游：CAG TAA TTC TAG GCG ATC GCA GGA GCC CAC GTG GGC CTCT，下游：AGA TAT TTT ATT GCG GCC AGC CCC AGT AGC AGC GAG AGG CC）；突變型引物序列（上游：CAG TAA TTC TAG GCG ATC GCA GGA GCC CAC GTG GGC CTCT，下游：AGA TAT TTT ATT GCG GCC AGC CAA AGT CTC CAG TGG GTC CA） 由Integrated DNA Technologies 公司（美國(guó)） 提供。新構(gòu)建質(zhì)粒經(jīng)小提、酶切驗(yàn)證后再經(jīng)大提擴(kuò)增，然后經(jīng)慢病毒包裝、轉(zhuǎn)染，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞后行下一步功能實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較兩組間各指標(biāo)水平差異，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 同時(shí)在肝癌組織及血清/血漿中都差異表達(dá)的miRNA篩選并驗(yàn)證

首先，從已發(fā)表[18]的在肝癌腫瘤組織及血清/血漿中都差異表達(dá)的miRNA（與正常組織/血液標(biāo)本相比）中篩選出同時(shí)在癌組織及肝癌患者血清/血漿中均差異表達(dá)的miRNA 共6 個(gè)（4 個(gè)上調(diào)：miR-18a-3p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-224-3p；2 個(gè)下調(diào)：miR-26a-3p、miR-125b-3p）（圖1A）。然后用qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些miRNA 在細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果提示，與正常肝細(xì)胞相比，miR-18-3p 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，miR-26a-3p 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)（圖1B-C）。

圖1 差異表達(dá)miRNA篩選及驗(yàn)證 A：從已發(fā)表文章中篩選出肝癌中差異表達(dá)的6個(gè)miRNA；B：6個(gè)miRNA在正常肝細(xì)胞L-02及肝癌細(xì)胞HA22T中的表達(dá)情況；C：6個(gè)miRNA在正常肝細(xì)胞L-02及肝癌細(xì)胞SK-HEP-1中的表達(dá)情況Figure 1 Screening and validation of the differentially-expressed miRNAs A: Six miRNAs screened out from the published studies; B: Expression of 6 miRNAs in normal hepatic L-02 cells and liver cancer HA22T cells; C: Expression of 6 miRNAs in normal hepatic L-02 cells and liver cancer SK-HEP-1 cells

2.2 miR-18a-3p 與miR-26a-3p 對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力的影響

過(guò)表達(dá)miR-18a-3p/miR-18a-3p 抑制劑能明顯促進(jìn)/抑制肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力（均P<0.05）（圖2A-D），而過(guò)表達(dá)miR-26a-3p/miR-26a-3p 抑制劑無(wú)法得到一致性結(jié)果（圖2E-H）。

圖2 miR-18a-3p、miR-26a-3p對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲及增殖能力的影響 A-B：過(guò)表達(dá)miR-18a-3p/抑制miR-18a-3p后肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化；C-D：過(guò)表達(dá)miR-18a-3p/抑制miR-18a-3p 后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化；E-F：過(guò)表達(dá)miR-26a-3p/miR-26a-3p 抑制劑后肝癌細(xì)胞侵襲能力的變化；G-H：過(guò)表達(dá)miR-26a-3p/miR-26a-3p 抑制劑后肝癌細(xì)胞增殖能力的變化Figure 2 Influences of miR-18a-3p and miR-26a-3p on invasion and proliferation abilities of liver cancer cells A-B:Changes in invasion ability of liver cancer cells after overexpression miR-18a-3p/miR-18a-3p inhibitor; C-D: Changes in proliferation ability of liver cancer cells after overexpression miR-18a-3p/miR-18a-3p inhibitor; E-F: Changes in invasion ability of liver cancer cells after miR-26a-3p overexpression/miR-26a-3p inhibiton; G-H: Changes in proliferation ability of liver cancer cells after miR-26a-3p overexpression/miR-26a-3p inhibiton

2.3 臨床組織樣本檢驗(yàn)miR-18a-3p 的表達(dá)及miR-18a的表達(dá)與肝癌的生存關(guān)系

在30 例肝癌患者的癌和癌旁組織標(biāo)本中檢驗(yàn)了miR-18a-3p 的表達(dá)情況，結(jié)果顯示肝癌組織中miR-18a-3p 的表達(dá)明顯高于癌旁組織（P<0.01）（圖3A）。 同時(shí)，通過(guò)KM plotter 網(wǎng)站（http://kmplot.com）分析了miR-18a 的表達(dá)與肝癌的生存關(guān)系，結(jié)果表明，miR-18a 表達(dá)越高，肝癌患者的生存預(yù)后越差（P=0.001 9）（圖3B）。

圖3 組織標(biāo)本驗(yàn)證miR-18a-3p的表達(dá)及miR-18a的表達(dá)與肝癌患者的生存關(guān)系 A：30對(duì)臨床標(biāo)本中miR-18a-3p的表達(dá)情況；B：KM plotter網(wǎng)站分析miR-18a的表達(dá)與肝癌的生存關(guān)系Figure 3 Validation of miR-18a-3p expression in tissue samples and relationship between miR-18a expression and survival of liver cancer patients A: The miR-18a-3p expressions in 30 paired clinical specimens; B:Analysis of the relationship between miR-18a expression and survival of liver cancer patients using KM plotter website

2.4 miR-18a-3p靶基因分析及逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步研究miR-18a 調(diào)控肝癌進(jìn)展的具體機(jī)制，通過(guò)miRDB 網(wǎng)站（http://mirdb.org/） 預(yù)測(cè)能被miR-18a-3p 靶向調(diào)控的下游基因，并選取其中得分>95 分的基因（SNX8、FNDC5、EFNA1、ZBBX、ADCY1、PDP1）（圖4A）。然后，通過(guò)GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析以上6 個(gè)基因在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SNX8 在肝癌組織中表達(dá)升高，ADCY1 在肝癌組織中表達(dá)明顯降低（圖4B）。由于通常miRNA 能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)抑制下游基因的表達(dá)， 因此推測(cè)miR-18a-3p 可能通過(guò)調(diào)控ADCY1 的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力。逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ADCY1 能部分逆轉(zhuǎn)miR-18a-3p 對(duì)肝癌的調(diào)控作用（圖4C-D）。

圖4 miR-18a-3p與ADCY1的關(guān)系分析 A：miRDB網(wǎng)站預(yù)測(cè)能被miR-18a-3p靶向調(diào)控的6個(gè)下游基因；B：GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析以上6個(gè)基因在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況；C-D：同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-18a-3p及ADCY1后檢測(cè)肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力Figure 4 Analysis of relationship between miR-18a-3p and ADCY1 A:The 6 downstream genes potentially regulated by miR-18a-3p predicted by miRDB website; B:Analysis the expressions of the 6 genes in liver cancer and adjacent tissues using GEPIA database; C-D: Invasion and proliferation abilities of liver cancer cells after co-overexpression of miR-18a-3p and ADCY1

2.5 miR-18a-3p與ADCY1 mRNA的關(guān)系分析

為研究miR-18a-3p 調(diào)控ADCY1 的機(jī)制，預(yù)測(cè)ADCY1 mRNA 3'UTR 前2 200 bp 區(qū)域能與miR-18a-3p結(jié)合的靶點(diǎn)，并構(gòu)建相應(yīng)的野生型和突變型質(zhì)粒（圖5A）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-18a-3p/miR-18a-3p 抑制劑能降低/增加轉(zhuǎn)染野生型ADCY1 3'UTR 肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性，而對(duì)轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒的細(xì)胞無(wú)明顯影響。由此表明miR-18a-3p 能通過(guò)直接結(jié)合到ADCY1 mRNA 3'UTR區(qū)域轉(zhuǎn)錄后調(diào)控ADCY1 的表達(dá)（圖5B）。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) A：miR-18a-3p與ADCY1結(jié)合位點(diǎn)的模式圖及野生型、突變型質(zhì)粒構(gòu)建原理；B：轉(zhuǎn)染野生型或突變型質(zhì)粒后肝癌細(xì)胞的熒光素酶活性Figure 5 Dual-luciferase reporter assay A: Pattern of the binding site between miR-18a-3p and ADCY1, and construction principle of the wild-type and mutant-type plasmids;B:Luciferase activities of the liver cancer cells after transfection with wild-type and mutant-type plasmids

3 討 論

全世界每年有超過(guò)850 000 例診斷為肝癌的患者[19]，肝癌目前是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，并且這一數(shù)字還在逐年上升[20]。在所有原發(fā)性肝癌中，肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的類型，約占所有病例的90%[19,21-22]。肝癌的預(yù)后差，具有高轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率，且5年生存率低。肝癌治療領(lǐng)域的特點(diǎn)是多學(xué)科參與、多種治療方法共存，常見(jiàn)治療方法包括肝切除術(shù)、肝移植術(shù)、消融治療、TACE、放射治療、系統(tǒng)抗腫瘤治療等多種手段，不同分期的肝癌患者選擇合理的治療方法可以使療效最大化[23]。目前肝癌的研究致力于尋找肝癌新的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)治療新策略，這對(duì)于那些手術(shù)治療效果欠佳或相關(guān)抗腫瘤藥物治療效果不好的患者尤為重要。本研究探討了肝癌進(jìn)展的新的分子信號(hào)通路，對(duì)肝癌新治療靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)、增加肝癌治療效果、促進(jìn)肝癌患者預(yù)后提供了理論支撐。

非編碼RNA 已經(jīng)被證實(shí)在多種疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]，miRNA正是其中一種起重要作用的非編碼RNA。miRNA的定義基于它們?cè)贒icer 的作用下生成，Dicer 是一種核糖核酸酶，可將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體（稱為premiRNA）加工成成熟的miRNA[25]。miRNA 通過(guò)識(shí)別目標(biāo)mRNA 的3'UTR 中的互補(bǔ)目標(biāo)位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)。miRNA 已經(jīng)被證實(shí)可以參與多種生物學(xué)進(jìn)程，包括腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。Wei等[26]報(bào)道m(xù)iR-223 可以抑制FOXO1 的表達(dá)，并可作為乳腺癌的潛在的腫瘤標(biāo)志物。Liu 等[27]研究表明來(lái)源于巨噬細(xì)胞的miR-92a-2-5p 能夠通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)到肝癌細(xì)胞并促進(jìn)肝癌進(jìn)展。Chen 等[28]報(bào)道m(xù)iR-206 可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)ZEB2 的表達(dá)來(lái)影響腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。以上研究都表明miRNA 在腫瘤的生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，并可作為多種腫瘤的生物標(biāo)記物。本研究通過(guò)收集肝癌相關(guān)miRNA 的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，并通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-18a-3p 在肝癌細(xì)胞及組織中表達(dá)上調(diào)，并能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移能力還能通過(guò)調(diào)控下游基因ADCY1 的表達(dá)來(lái)影響肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力，從理論水平進(jìn)一步證實(shí)了miRNA 在肝癌中發(fā)揮重要作用，并為尋找肝癌診治的新靶標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

ADCY1 是ADCY 超家族的成員， 它位于7p12.3，包含22 個(gè)外顯子；其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分子量為130 kD。ADCY1 主要表達(dá)于腦、睪丸、甲狀腺、肝臟、前列腺、子宮內(nèi)膜、心臟等組織器官。已有相關(guān)研究報(bào)道了ADCY1 在許多疾病中發(fā)揮重要作用。研究[29]表明ADCY1 與黑色素瘤患者的總生存期顯著相關(guān)，并在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用。此外，有研究[30]報(bào)道ADCY1 在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，并與其患者的預(yù)后相關(guān)。Ma 等[31]報(bào)道了ADCY1 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高甲基化并與惡性膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間相關(guān)。目前尚未有研究報(bào)道ADCY1 在肝癌中的作用機(jī)制。本研究通過(guò)miR-18a-3p 預(yù)測(cè)了ADCY1 可能是其作用的靶基因，并通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)了ADCY1 在肝癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)ADCY1 能抑制肝癌的生長(zhǎng)及侵襲能力，逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)ADCY1 能夠部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-18a-3p 對(duì)肝癌生長(zhǎng)及侵襲能力的影響，進(jìn)一步證實(shí)miR-18a-3p 可以通過(guò)ADCY1發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了miR-18a-3p 通過(guò)結(jié)合到ADCY1 mRNA 3'UTR，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控ADCY1 而抑制ADCY1 的表達(dá)。由此，本研究從多方面證實(shí)了ADCY1 可以在miR-18a-3p 的調(diào)節(jié)下影響肝癌的進(jìn)展，進(jìn)一步表明ADCY1 可以作為肝癌診治的潛在標(biāo)志物。

miR-18a-3p 在肝癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，并可通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制下游ADCY1 基因的表達(dá)，以此促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲及增殖能力。本研究結(jié)果可為尋找肝癌治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。