張彥收，劉運江

（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心，河北 石家莊 050011）

目前，乳腺癌已成為威脅女性健康最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示：乳腺癌新發(fā)病例226 萬例，并已超過肺癌成為全球第一大癌癥[1]。近年來，隨著新型藥物的開發(fā)和精準治療的不斷推進，乳腺癌的治療已由傳統(tǒng)經(jīng)驗模式過渡到基于不同分子分型的個體化精準治療時代[2-3]。不斷開發(fā)新的分子標志物和靶向治療藥物，可以更精準化地改善乳腺癌患者的預后。

富亮氨酸α2 糖蛋白1 （leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1， LRG1） 是富亮氨酸重復序列（leucine-rich repeat，LRR）蛋白家族成員，也是最早被發(fā)現(xiàn)的含有LRR 結(jié)構(gòu)的蛋白。近些年研究顯示LRG1 在腫瘤的發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移、異常血管生成、預后預測中扮演著重要角色[4-7]。然而，目前LRG1 在乳腺癌組織中表達與臨床病理特征的關(guān)系、預后價值、分子功能和作用機制尚未闡明。本研究旨在通過生物信息學方法，明確LRG1 在乳腺癌中的表達特點及其與預后的關(guān)系，以期揭示LRG1 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為進一步探索LRG1 的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（http://www.tcga.org）中包括乳腺癌組織及正常組織中RNA-seq 的測序結(jié)果[8]。利用UALCAN 在線工具（http://www.ualcan.path.uab.edu）[9]分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中LRG1 mRNA 的表達情況。

1.2 生存分析

利用 GEPIA （http://gepia.cancer-pku.cn）[10]、Kaplan-Meier plotter （http://kmplot.com/analysis）[11]平臺獲取TCGA 數(shù)據(jù)庫中乳腺癌患者的臨床特征及生存資料，分析LRG1 的表達與總生存期（overall survival，OS） 和無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）之間的關(guān)系，并繪制Kaplan-Meier 曲線。

1.3 功能分析

利用GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫[12]繪制LRG1 相關(guān)的蛋白、遺傳相互作用通路和蛋白共表達網(wǎng)絡。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫[13]進行基因功能富集分析，了解與LRG1 相互作用的關(guān)鍵基因以及參與的細胞組分、生物過程、生物功能。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用TPM （transcripts per million） 作 為LRG1 mRNA 表達量度，表達量使用中位數(shù)（四分位間距） 來表示。采用Kaplan-Meier 生存曲線對LRG1高、低表達組患者進行生存比較，計算95%置信區(qū)間（CI）的危險比（HR）和Log-rankP值。統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 LRG1 在乳腺癌中的表達及其與分子亞型、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系

使用UALCAN 在線工具分析TCGA 中1 097 例乳腺浸潤性癌和114 例正常乳腺組織的數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示LRG1 mRNA 在正常乳腺組織中位表達量為8.357 （4.402～14.021），在乳腺癌組織中表達量為23.461（3.158～63.676），LRG1 在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織（P<0.000 1）（圖1）。

圖1 LRG1 在乳腺浸潤性癌及癌旁正常組織中表達（UALCAN）Figure 1 LRG1 expressions in invasive breast carcinoma and normal tissue(UALCAN)

進一步分析乳腺癌不同亞型中LRG1 的表達，566 例luminal 型乳腺癌中LRG1 表達量為37.462（9.93～74.197），高于HER-2 陽性型和三陰性乳 腺 癌（triple-negative breast cancer，TNBC）（P<0.01）。37 例HER-2 陽性型乳腺癌組織中LRG1 表達量為3.609 （0.852～29.732），116 例TNBC 組織中表達量為1.028（0.516～4.027）（圖2）。

圖2 LRG1在乳腺癌不同亞型中表達（UALCAN）Figure 2 LRG1 expressions in different subtypes of breast cancer(UALCAN)

進一步分析LRG1 在不同臨床分期乳腺癌中表達情況。183 例I 期乳腺癌組織中LRG1 表達量為34.684（3.036～84.648），615 例II 期乳腺癌中表達量為22.553（3.036～84.648），在247 例III 期乳腺癌中表達量為22.677 （4.347～52.772），在20 例IV 期乳腺癌組織中表達量為13.667 （3.931～22.511）。I、II、III 期乳腺癌中LRG1 mRNA 的表達水平均高于正常乳腺組織（均P<0.05）（圖3）。

圖3 LRG1在乳腺癌不同分期中表達（UALCAN）Figure 3 LRG1 expressions in breast cancer of different stages(UALCAN)

分析Breast Cancer Gene-Expression Miner 數(shù)據(jù)庫（包含TCGA 數(shù)據(jù)庫中1 034 例乳腺癌）[14]中3 911 例ER 陽 性、551 例ER 陰 性、3 498 例PR 陽 性 和828 例PR 陰性乳腺癌，發(fā)現(xiàn)LRG1 在ER、PR 雙陽性乳腺癌中的表達明顯高于ER、PR 均陰性乳腺癌，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）。ER 陽性、PR 陽性組表達水平高于ER 陰性、PR 陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）。3 582 例HER-2 陰性組LRG1 表達高于661 例HER-2 陽性組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.000 1）（圖4）。根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進一步分析顯示，LRG1 在1 646 例淋巴結(jié)陽性患者中的表達高于2 415 例淋巴結(jié)陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.007 0）（圖5）。

圖4 LRG1在不同激素受體狀態(tài)乳腺癌中的表達（bc-GenExMiner）Figure 4 LRG1 expressions in breast cancer with different hormone receptor statuses(bc-GenExMiner)

圖5 LRG1 在不同淋巴結(jié)狀態(tài)乳腺癌中的表達（bc-GenExMiner）Figure 5 LRG1 expressions in breast cancer with different lymph node statuses(bc-GenExMiner)

2.2 LRG1的表達與乳腺癌預后關(guān)系

利用GEPIA 在線平臺，分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中1 070 例乳腺浸潤性癌患者的OS 及RFS，并繪制生存曲線。結(jié)果顯示：隨著隨訪時間的延長，535 例LRG1 高表達組患者OS 及RFS 均低于535 例低表達組，但差異未達統(tǒng)計學意義（HR=0.81，P=0.2；HR=0.7，P=0.064）（圖6）。利用Kaplan-Meier plotter在線工具分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中不同分子亞型預后，LRG1 的表達與luminal A 型、luminal B 型、HER-2陽性型乳腺癌的OS 無明顯關(guān)系（均P>0.05），但在basal-like 亞型中，LRG1 的表達卻與OS 明顯相關(guān)，LRG1 表達低的患者OS 更好（HR=3.12，95%CI=1.54～6.29，P=0.000 84）（圖7）。

圖6 LRG1表達與乳腺癌的預后的關(guān)系（GEPIA）Figure 6 Relationship of LRG1 expression with the prognosis of breast cancer(GEPIA)

圖7 不同分子亞型乳腺癌中LRG1的表達與OS的關(guān)系（Kaplan-Meier plotter）Figure 7 Relationship of LRG1 expression with the OS in breast cancer of different subtypes(Kaplan-Meier plotter)

2.3 LRG1相互蛋白作用網(wǎng)絡預測及功能分析

利用GeneMANIA 數(shù)據(jù)庫分析篩選出20 個與LRG1 相互作用蛋白質(zhì)，分別為CYCS、NME2、ACVRL1、ENG、TGFBR1、TGFBR2、CFB、FGGY、C2、SDS、ORM2、HAL、CEBPA、CRP、C4BPA、CEBPE、SAA2、IGFALS、HAMP、PJA1。其相互作用關(guān)系包括物理相互作用、共表達、相互預測、共定位，遺傳相互作用（圖8）。

圖8 LRG1相互作用蛋白網(wǎng)絡分析Figure 8 Analysis of LRG1 interacting protein network

2.4 GO分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析，結(jié)果顯示，LRG1 及其共表達相關(guān)的20 個蛋白富集于細胞胞外區(qū)，外泌體，血液微粒，受體復合物等結(jié)構(gòu)中，共同參與細胞的血管生成調(diào)控、上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化、缺氧反應等相關(guān)生物學過程（圖9）。

圖9 LRG1相關(guān)蛋白參與的細胞生物學過程、分子功能及細胞組分Figure 9 Cellular biological processes,molecular functions and cellular components of LRG1 related proteins

3 討 論

早期研究[15]認為LRG1 可能是中性粒細胞早期分化的標志物。隨著分子生物學不斷發(fā)展，LRG1其他功能陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)：它不僅參與細胞蛋白間的相互作用，同時在信號轉(zhuǎn)導、細胞黏附及細胞發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用，尤其在腫瘤的發(fā)生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移和異常血管生成中也扮演了重要角色。

LRG1 在多種惡性腫瘤組織中的表達呈上調(diào)狀態(tài)。Hong 等[6]發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌中LRG1 存在過表達，并與患者生存率呈負相關(guān)。Li 等[16]報道在非小細胞肺癌的尿樣和肺癌組織中LRG1 表達明顯升高。Andersen 等[17]通過Western blot 技術(shù)檢查了58 例卵巢癌患者血清、腫瘤組織和細胞系中LRG1 的表達，與對照組相比，LRG1 在卵巢癌患者的血清和腫瘤組織中均存在表達上調(diào)。在胰腺疾病中，與慢性胰腺炎患者和健康志愿者相比，胰腺癌患者血清中LRG1 水平顯著升高，并且LRG1 表達水平隨著胰腺癌疾病進展而升高[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRG1 在浸潤性乳腺癌組織中表達明顯高于正常組織。筆者先前研究[19]通過免疫組化技術(shù)檢測了330 例原發(fā)性乳腺癌組織中LRG1 蛋白的表達，結(jié)果顯示，LRG1 蛋白在乳腺癌組織中的陽性表達率為58.48%（193/330），較正常乳腺組織明顯升高。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的分析和蛋白表達的驗證表明，乳腺癌組織中LRG1mRNA 與蛋白表達均明顯上調(diào)。TCGA 數(shù)據(jù)庫中顯示LRG1 在不同分子亞型中表達存在差異性，luminal 型乳腺癌中LRG1 表達顯著高于HER-2 陽性型乳腺癌和TNBC。但不同觀點認為LRG1 和PLCL1 的表達與luminal 亞型無關(guān)。先前的研究[19]同樣未發(fā)現(xiàn)LRG1 蛋白在不同分子亞型中未呈現(xiàn)差異。分析原因，可能與研究入組樣本數(shù)和組織異質(zhì)性相關(guān)，未來仍需進一步擴大樣本量再次進行驗證。

LRG1 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用仍不明確。Zhong 等[21]報道沉默LRG1 可減少細胞周期蛋白B、D1 和E 的表達，并使細胞抑制在G0/1期。腦膠質(zhì)瘤細胞中LRG1 過表達后出現(xiàn)TGF-β1、PSmad2 和P-Smad3 蛋白水平上調(diào)，E-cadherin 蛋白水平下降，而Smad2/3 的活化可促進細胞侵襲和遷移[22]。LRG1 在視網(wǎng)膜血管疾病可能是通過TGF-β信號傳導通路促進腫瘤血管生成[23-25]。李金梅等[26]報道胃癌組織中LRG1 蛋白的表達與腫瘤微血管密度（MVD）相關(guān)，推測LRG1 通過調(diào)節(jié)TGF-β 信號通路促進胃癌中微血管的生成。Ronald 等[27]研究證實LRG1 與凋亡激活因子1（Apaf-1）競爭性結(jié)合細胞色素c（Cyt c），抑制MCF-7 細胞凋亡。Ban 等[28]報道LRG1 在甲狀腺癌中表達與存活率低和腫瘤分期晚相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)LRG1 在淋巴結(jié)陽性組患者中的表達高于淋巴結(jié)陰性組，提示LRG1 與乳腺癌局部進展可能有關(guān)。富集分析發(fā)現(xiàn)LRG1 及其共表達相關(guān)的20 個蛋白富集于細胞胞外區(qū)、外泌體、血液微粒及受體復合物等結(jié)構(gòu)中，共同參與了細胞的血管生成調(diào)控、上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化、缺氧反應等相關(guān)生物學過程。LRG1 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能涉及多個通路，通過進一步的基礎(chǔ)研究實驗闡明其作用機制，可能為乳腺癌提供新的治療靶點，從而進一步改善患者預后。

LRG1 在腫瘤預后預測方面也有相關(guān)報道。Sun 等[7]報道在III 期結(jié)直腸癌中，LRG1 蛋白表達與MVD 和其他臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，包括腫瘤T 分期、組織分化和血管浸潤，Cox 多元回歸分析顯示LRG1 蛋白是DFS 和OS 獨立的不良預測因素。梁棟等[29]報道在子宮內(nèi)膜癌患者中，LAPTM4B-35、LRG1 高表達患者術(shù)后5年生存率差于低表達者。Wang 等[30]研究顯示，LRG1 在肝癌組織中的表達顯著增加，LRG1 與OS、DFS 密切相關(guān)，多元Cox 回歸模型分析表明LRG1 是OS 和DFS 的獨立不良預后因素。在本研究中，TCGA 數(shù)據(jù)庫中生存分析結(jié)果顯示：LRG1 的表達與luminal A 型、luminal B、HER-2 陽性型乳腺癌的OS 無明顯關(guān)系，但在basallike 亞型中，LRG1 的表達與OS 呈顯著相關(guān)，LRG1低表達的患者OS 更好（HR=3.12，95%CI=1.54～6.29，P<0.001）。LRG1 在basal-like 亞型乳腺癌中具體作用仍不明確。Hanif 等[31]報道LRG1 表達上調(diào)可導致TNBC 細胞中出現(xiàn)明顯FEC 化療方案藥物耐藥，可能導致不良預后。其他觀點[20]認為LRG1 表達與乳腺癌的OS 和無進展生存期相關(guān)，推測可能原因是后者納入研究人群主要為既往接受新輔助治療的乳腺癌患者。LRG1 在乳腺癌中預后預測價值未來仍需大樣本數(shù)據(jù)進行驗證。

本研究僅對數(shù)據(jù)庫中乳腺癌LRG1 的表達進行了差異分析和預后探索，缺少體內(nèi)和體外實驗證據(jù)支持。此外，對于LRG1 在乳腺癌中的具體作用機制缺乏了解，后期將通過設(shè)計具體實驗進一步探索LRG1 在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制。

綜上所述，LRG1 在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達，淋巴結(jié)陽性患者中LRG1 表達明顯高于陰性組，且與basal-like 亞型乳腺癌患者不良預后相關(guān)。在未來抗腫瘤治療中，LRG1 有可能作為一種新的腫瘤分子標志物，為乳腺癌的診斷和治療提供新的思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。