陳娟，蔣斌，黃果，賀秋冬

（南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1.放療科2.整形美容科，湖南 衡陽 421001；3.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，湖南 衡陽 421001）

乳腺癌發(fā)病率約占所有女性癌癥的30%，病死率為15%[1]?；熞驯蛔C明可通過誘導(dǎo)I 型干擾素（Interferon type I，IFN-I）反應(yīng)增強(qiáng)抗腫瘤免疫力[2-3]，可以激活抗腫瘤免疫細(xì)胞并重新編程炎癥性腫瘤的微環(huán)境[4]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumorassociated macrophages，TAMs） 是腫瘤微環(huán)境中炎癥浸潤的一種主要細(xì)胞成分，通常具有抗炎表型（M2），可促進(jìn)腫瘤生長和免疫抑制。研究[5]報(bào)道乳腺癌化療后腫瘤中產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞可以通過NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞因子，包括IL-6、IL-8 和TNF-α 促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，還可通過STAT1 介導(dǎo)的細(xì)胞因子，包括CXCL9、CXCL10 和IL-15，促進(jìn)抗腫瘤免疫。腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞，包括B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)癌癥進(jìn)展，為腫瘤的治療提供新靶點(diǎn)。新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）在乳腺癌的治療中發(fā)揮著重要作用，可以減瘤降期，增加保乳幾率，還可能通過消除遠(yuǎn)處隱匿性微轉(zhuǎn)移改善患者總生存[6]。近期研究[7-8]表明，NAC 不僅通過對腫瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒性發(fā)揮其臨床作用，還通過增強(qiáng)惡性腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫力來發(fā)揮作用。本文通過GEO 數(shù)據(jù)庫下載乳腺癌化療前后數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，明確化療前后患者TAMs 變化，評估化療對乳腺癌患者免疫影響，為后期免疫治療提供理論思路。

1 材料與方法

1.1 TAMs相關(guān)數(shù)據(jù)下載及分析

通過GEO 數(shù)據(jù)庫[9]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds） 輸入Breast Cancer，TAMs，Chemotherapy 進(jìn) 行檢索， 通過比對， 選擇人乳腺癌組織的GSE134600[5]數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，其中包含4 對NAC 前后的乳腺癌樣本數(shù)據(jù)。

1.2 差異基因篩選

通過使用R 軟件（version 3.6.3）中affy 包[10]獲取數(shù)據(jù)集基因表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)，使用Normalize 函數(shù)對該數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一處理，通過R 包（limma 函數(shù)）篩選化療前后乳腺癌組織樣本的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選出|logFC|≥1 且校正后P<0.05 的DEG，logFC≥1 為上調(diào)基因，logFC≤-1 為下調(diào)基因。

1.3 DEGs功能富集及通路分析

使用DAVID 來分析GO 功能富集和KEGG 通路分析[11]，使用“ggplot2”R 包對富集分析進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建及關(guān)鍵基因篩選

使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）在線預(yù)測并分析篩選DEGs 之間的關(guān)聯(lián)性。獲得數(shù)據(jù)通過Cytoscape[12]軟件（3.8.0） 進(jìn)行可視化。并通過Cytohubba 插件篩選hub 核心基因，通過cBioPortal（https://www.cbioportal.org）對10 個關(guān)鍵基因進(jìn)行突變分析。

1.5 TAMs相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤的評估

GSE134600 數(shù)據(jù)集中4 對樣本數(shù)據(jù)通過CIBERSORT[13]標(biāo)準(zhǔn)，總T 細(xì)胞計(jì)算包括CD8+T 細(xì)胞、CD4+幼稚T 細(xì)胞、CD4+記憶靜止T 細(xì)胞、CD4+記憶激活T 細(xì)胞、卵泡輔助T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）和γδT 細(xì)胞的總和。總巨噬細(xì)胞為M0、M1和M2 巨噬細(xì)胞的總和?？侭 細(xì)胞為B 細(xì)胞及記憶性B 細(xì)胞的總和。同時應(yīng)用CIBERSORT 包進(jìn)行免疫細(xì)胞浸潤的評估。使用barplot 函數(shù)、pheatmap 函數(shù)、vioplot 函數(shù)、corrplot 函數(shù)分別進(jìn)行可視化繪圖。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs篩選及相關(guān)性分析

將NAC 前后兩組乳腺癌測序數(shù)據(jù)進(jìn)行DEGs 分析，篩選出751 個DEGs（409 個上調(diào)基因和342 個下調(diào)基因），選擇兩組表達(dá)差異前20 位的基因繪制火山圖（圖1A）、熱圖（圖1B）以及相關(guān)性熱圖（圖1C）。

圖1 NAC前后DEGs A：火山圖；B：熱圖；C：DEGs的相關(guān)性分析Figure 1 The DEGs before and after NAC A:Volcanic map;B:Heat map;C:Correlation analysis of DEGs

2.2 差異表達(dá)基因GO 功能富集和KEGG 通路富集分析

為了明確乳腺癌化療前后在生物功能上差異，對上述篩選的DEGs 進(jìn)行功能富集分析。通過GO富集分析DEGs 的生物過程（Biological Process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。在BP 中主要富集在IFN-I 信號通路/病毒應(yīng)答與防御和病毒生命周期方面；在CC 中主要富集在細(xì)胞膜的外在成分和細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)方面；在MF 中主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、雙鏈RNA 結(jié)合和脂肽結(jié)合方面（圖2A）。KEGG 通路富集分析中，DEGs 主要富集在甲型H1N1 流感、麻疹、丙型肝炎、冠狀病毒COVID-19、NF-κB 信號通路、EBV 病毒感染、NOD樣受體信號通路和阿米巴病信號通路（圖2B）。

圖2 DEGs功能富集分析 A：GO功能富集分析；B：KEGG通路分析Figure 2 Functional enrichment analysis of DEGs A:GO enrichment analysis;B:KEGG pathways analysis

2.3 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因突變可視化

將DEGs 導(dǎo)入String 平臺后，按照交互評分為0.95 處理后得到節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)并繪制PPI 圖（圖3）。將獲得節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)通過CytoHubba 插件篩選與乳腺癌NAC 前后TAMs 相互作用程度最高的前10 個DEGs 作為關(guān)鍵基因：干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)蛋白1（interferoninduced protein with tetratricopeptide repeats 1，IFIT1）、干擾素刺激基因15 （IFN-stimulated gene，ISG15）、黏病毒耐藥蛋白1（recombinant myxovirus resistance 1，MX1）、黏病毒耐藥蛋白2 （recombinant myxovirus resistance 2，MX2）、干擾素調(diào)節(jié)因子7 （interferon regulatory factor 7，IRF7）、S-腺苷甲硫氨酸基區(qū)域蛋白 2 （radical S-adenosyl methionine domain containing 2，RSAD2）、干擾素誘導(dǎo)的四肽重復(fù)蛋白3 （interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3，IFIT3）、干擾素誘導(dǎo)蛋白35（interferoninduced protein 35， IFI35）、 干擾素誘導(dǎo)蛋白6（interferon-induced protein 6，IFI6）、干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白1（interferon induced transmembrane protein 1，IFITM1）。通過cBioPortal 進(jìn)行多組學(xué)分析10 個關(guān)鍵基因突變情況，IFIT1、MX1 和MX2 主要發(fā)生缺失突變，IFIT1 主要發(fā)生基因深度刪除，而MX1 和MX2 主要發(fā)生基因擴(kuò)增。

圖3 DEGs相互作用及關(guān)鍵基因突變 A：PPI網(wǎng)絡(luò)圖評估DEGs相互作用關(guān)系；B：10個關(guān)鍵基因；C：關(guān)鍵基因突變Figure 3 Interactions of DEGs and hub genes mutations A: PPI network diagram of DEGs corresponding proteins; B:The 10 hub genes;C:Mutations of the hub genes

2.4 乳腺癌NAC前后免疫細(xì)胞占比和含量分析

通過CIBERSORT 包對NAC 前后乳腺癌組織中免疫細(xì)胞分布情況進(jìn)行發(fā)現(xiàn)，占比最高的10 個免疫細(xì)胞分別是：M0 巨噬細(xì)胞、活化的樹狀突細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、活化的自然NK 細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞、記憶性B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞（圖4A）。對乳腺癌免疫細(xì)胞進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析發(fā)現(xiàn)M0 巨噬細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞及M2 巨噬細(xì)胞含量減少（圖4B），可能是影響乳腺癌NAC 前后TAMs 相關(guān)基因表達(dá)差異的主要原因。

圖4 免疫細(xì)胞占比及含量 A：22種免疫細(xì)胞的比例；B：22種免疫細(xì)胞的熱圖Figure 4 Proportion and content of immune cells A: The proportion of 22 kinds of immune cells; B: Heatmap of 22 immune cells

2.5 乳腺癌NAC前后免疫細(xì)胞的相關(guān)分析

乳腺癌NAC 前后免疫細(xì)胞表達(dá)相關(guān)系數(shù)較大的有：呈正相關(guān)主要有M0 巨噬細(xì)胞與記憶性B 細(xì)胞（0.64）、未活化的NK 細(xì)胞與活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞（0.91）、初始CD4+T 細(xì)胞（0.93）、活化的樹突狀細(xì)胞（0.73）、活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞與初始CD4+T 細(xì)胞活化（0.94）、樹突狀細(xì)胞（0.67）、CD8+T 細(xì)胞（0.61）、未活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞與M1 巨噬細(xì)胞（0.91）、γδT 細(xì)胞（0.70）、單核細(xì)胞（0.71）、活化的NK 細(xì)胞與γδT 細(xì)胞（0.69），上述正相關(guān)免疫細(xì)胞在乳腺癌NAC 前后過程中起相互協(xié)同作用。呈負(fù)相關(guān)的可見CD8+T 細(xì)胞與單核細(xì)胞（-0.85）、未活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞（-0.68）、M2 巨噬細(xì)胞與活化的樹突細(xì)胞（-0.7）、活化的樹突細(xì)胞與未活化的樹突細(xì)胞（-0.78）、單核細(xì)胞與CD4+記憶性T 細(xì)胞（-0.77）、嗜酸性粒細(xì)胞與濾泡輔助性T 細(xì)胞（-0.85）、記憶性B 細(xì)胞與M1巨噬細(xì)胞（-0.67）、M0巨噬細(xì)胞與未活化的CD4+記憶性T 細(xì)胞（-0.66）、M1 巨噬細(xì)胞（-0.83），以上負(fù)相關(guān)提示在免疫細(xì)胞之間相互抑制（圖5）。

圖5 免疫細(xì)胞比例的相關(guān)性Figure 5 Correlations between the proportions of the immune cells

3 討 論

根據(jù)《2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告》，乳腺癌已經(jīng)超過肺癌，成為女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，新增病例約230 萬例，乳腺癌已成為癌癥的第五大死因[14]。乳腺癌占女性癌癥總數(shù)的30%，原發(fā)性乳腺腫瘤本身并不是乳腺癌患者的主要死因，對化療藥物的耐藥性、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性是病死率增加的主要原因。一旦轉(zhuǎn)移發(fā)生，患者5年生存率只有25%[15]。盡管化療藥物具有一定的抑制特性，但一些臨床證據(jù)[16]表明，化療藥物可能通過改變腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)NAC 對三陰性乳腺癌的免疫作用從而發(fā)揮抗腫瘤作用，但是具體的機(jī)制及功能尚不清楚。NAC 后，殘留腫瘤中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs） 的存在可能與三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC） 亞型的良好預(yù)后有關(guān)[17]。在使用含阿霉素方案進(jìn)行NAC 后，殘留乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞高度浸潤[18]。阿霉素不僅通過招募TILs，而且通過下調(diào)PD-1 和Tim-3 檢查點(diǎn)來增強(qiáng)抗腫瘤免疫[19]。

通過GSE134600 數(shù)據(jù)集篩選出NAC 前后乳腺癌組織樣本中的DEGs，通過功能富集分析發(fā)現(xiàn)，IFN-I 信號通路在影響乳腺癌生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。在膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，使用中等劑量間歇化療方案可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自主IFN-I 信號傳導(dǎo)，隨后釋放可溶性因子，激活腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤免疫細(xì)胞中的干擾素刺激基因，從而激活免疫原性細(xì)胞死亡[20]。蒽環(huán)類藥物在激活內(nèi)體模式識別受體Toll 樣受體3（TLR3）后刺激惡性細(xì)胞快速產(chǎn)生IFN-I，通過與腫瘤細(xì)胞上的干擾素α（IFNα） 和干擾素β 受體（IFNARs） 結(jié)合，I 型IFN-I 觸發(fā)自分泌和旁分泌回路，導(dǎo)致趨化因子（C-X-C 基序）配體10（CXCL10）的釋放，發(fā)揮抗腫瘤作用，但缺乏TLR3 或IFNα 會導(dǎo)致腫瘤對化療沒有反應(yīng)[21]。說明IFN-I 信號通路在乳腺癌NAC 中發(fā)揮重要的免疫原性作用，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

通過CytoHubba 插件篩選出與乳腺癌NAC 前后TAMs 密切相關(guān)的10 個對應(yīng)的蛋白：IFIT1、ISG15、MX1、MX2、IRF7、RSAD2、IFIT3、IFI35、IFI6、OAS2。研究[22]發(fā)現(xiàn)ISG15 在乳腺癌中高表達(dá)增加了乳腺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度。IFNα 已被用于治療包括乳腺癌在內(nèi)的各種類型癌癥，但其抗腫瘤活性相對較低，阻礙了其在臨床應(yīng)用。目前通過將MCF-7 結(jié)合肽（MBP）與IFNα 的c 端融合，構(gòu)建IFNα-MBP 融合分子（IMBP），其活性明顯高于IFNα。合成的IMBP 的活性增強(qiáng)也與STAT1 通路靶基因（STAT1、IFIT1、IFITM1 和MX1）的激活密切相關(guān)，IMBP 可以抑制細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡途徑增強(qiáng)了阿霉素對乳腺癌化療的治療效果[23]。雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞對阿霉素和甲氨蝶呤的化療誘導(dǎo)存在免疫休眠，主要是由于IRF7/IFN-β/IFNAR 軸的持續(xù)激活造成[24]。IRF7 上調(diào)主要通過抑制細(xì)胞主導(dǎo)的免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+/CD8+T 細(xì)胞依賴性抗腫瘤反應(yīng)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞對化療的耐藥[25]。IRF7 或IFNAR 沉默可逆轉(zhuǎn)休眠狀態(tài)，自發(fā)擺脫休眠與干擾素-β 產(chǎn)生密切相關(guān)。RSAD2 在TNBC 中上調(diào)，RSAD2 表達(dá)的增加與無病生存有關(guān)[26]。

在乳腺腫瘤微環(huán)境中，TAMs 是最豐富的免疫細(xì)胞，在乳腺癌發(fā)生和進(jìn)展過程中，TAMs 通過促進(jìn)血管生成和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)癌癥干性，調(diào)節(jié)能量代謝和支持免疫系統(tǒng)抑制來支持乳腺腫瘤的生長[27]。TAMs 表現(xiàn)出高度的細(xì)胞可塑性，將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞重新極化為M1 巨噬細(xì)胞抑制腫瘤生長，活化的M1 和M2 巨噬細(xì)胞的不同的免疫調(diào)節(jié)功能起到腫瘤的作用[28]，同時也參與腫瘤耐藥的調(diào)節(jié)[29]。本研究通過免疫浸潤分析，發(fā)現(xiàn)M0 巨噬細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞在乳腺癌化療后含量減少，而M1 巨噬細(xì)胞含量增加。相關(guān)性分析提示，M0、M2與M1 成負(fù)相關(guān)，說明化療可能造成M0、M2 含量降低，影響患者的免疫功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，成熟的樹突細(xì)胞與卵巢癌患者免疫浸潤和改善預(yù)后有關(guān)[30]。由SN-38 誘導(dǎo)的SW480 細(xì)胞上的MHC-I 類分子上調(diào)使SW480 細(xì)胞更容易受到免疫調(diào)節(jié)，從而被單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞吞噬，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[31]。本研究中發(fā)現(xiàn)活化的樹突狀細(xì)胞含量增加可能通過免疫調(diào)節(jié)增加乳腺癌患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)在基底樣乳腺癌中（basal-like breast cancer，BLBC）中IFNα、IFNγ、TNFα 通路活性明顯增加，但是TGFβ 活性明顯降低。IFNα、IFNγ、TNFα 通路活性與BLBC 復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)，TGFβ 通路與TNBC 復(fù)發(fā)呈正相關(guān)。BLBC 中的免疫細(xì)胞亞群分析顯示M0、M1 和M2 巨噬細(xì)胞水平與TNFα 或TGFβ 通路相關(guān)，而活化記憶CD4+T 細(xì)胞的水平與這兩種通路相關(guān)。此外，T 細(xì)胞亞群在具有低TGFβ 和高TNFα 通路活性的BLBC 中最為豐富。這些結(jié)果表明TNFα 和TGFβ 通路協(xié)同作用可能參與了BLBC中記憶T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)和抗癌免疫[32]。在乳腺癌患者化療中，順鉑可將單核細(xì)胞和M0 巨噬細(xì)胞極化為M2 樣表型，加入寡聚果糖可明顯減少M(fèi)0 巨噬細(xì)胞極化成M2 樣表型，寡聚果糖還可增加順鉑對乳腺癌細(xì)胞的毒性，防止M2 巨噬細(xì)胞分化。更重要的是，寡聚果糖抑制了腫瘤微環(huán)境中M2 巨噬細(xì)胞浸潤，從而增加抗腫瘤免疫[33]。

本文通過對現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者化療前有明顯的免疫細(xì)胞改變，同時預(yù)測化療前后患者體內(nèi)TAMs 變化主要與干擾素信號通路密切相關(guān)，提示在乳腺癌患者化療中可以加入干擾素進(jìn)行聯(lián)合處理，增加化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，從而獲得更優(yōu)的治療效果。但仍需對宿主、腫瘤和微環(huán)境參數(shù)行進(jìn)一步研究，以闡明這些化療與免疫之間可能存在的相關(guān)機(jī)制，以及在對乳腺癌患者的治療中合理選擇化療、靶向藥物和免疫治療藥物的組合，達(dá)到最佳治療效果。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。