呂金瑩，胡欣，鄧嘉胤

（天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院牙周科，天津 300070）

種植體周?chē)资侵赴l(fā)生在口腔種植體周?chē)浗M織的可逆炎癥，是以種植體上的細(xì)菌微生物感染為特征的炎性疾病[1]。目前種植體周?chē)椎闹委熓侄味际腔谘乐苎字委煹囊话阍瓌t，包括消除細(xì)菌微生物群，防止細(xì)菌定植和創(chuàng)造一個(gè)能夠抑制齦下細(xì)菌的生態(tài)環(huán)境[2-3]。種植體周?chē)椎某Ｒ?guī)治療手段包括機(jī)械治療和化學(xué)藥物治療，因?yàn)闄C(jī)械治療無(wú)法徹底清除粗糙表面的細(xì)菌，再加上抗生素具有較廣的抗菌譜，容易誘發(fā)菌群失衡，所以治療效果都不理想[4]?？咕氖巧锛?xì)胞特定基因編碼，是機(jī)體抵抗病原微生物時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)帶正電荷的防御性小分子多肽，具有穩(wěn)定性高、抗菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。RISE-AP12?是一種人工合成的新型抗菌肽，具有較好的生物學(xué)活性與較強(qiáng)的抗菌作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，安全性更高，在種植體周?chē)椎膽?yīng)用中具有較大的優(yōu)勢(shì)[7-8]。本研究旨在探討分析不同濃度的抗菌肽RISE-AP12?對(duì)鈦種植體周?chē)字饕虏【蜕锬どL(zhǎng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)菌株包括血鏈球菌（ATCC10556），牙齦卟啉單胞菌（ATCC33277），具核梭桿菌（ATCC10953）。

主要試劑與儀器包括鈦種植體（Ti6Al4V，規(guī)格：Φ3 mm×7 mm）；抗菌肽RISE-AP12?（由北京銳瑟生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司合成提供）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)HDPN-II-256 型）、低溫離心機(jī)（Grows Instrument TGL27A 型）、酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisherScientific）、厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)YQX-Ⅱ型）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海龍躍WJ-3-160T 型）。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽RISE-AP12?藥液的制備 用腦心浸液瓊脂（BHI）培養(yǎng)基將抗菌肽培養(yǎng)成濃度為0.1 g/L的母液，經(jīng)針孔濾器過(guò)濾消毒后儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)菌種的復(fù)蘇與培養(yǎng) 將具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌復(fù)蘇后接種于BHI 培養(yǎng)基，37℃下專(zhuān)性厭氧環(huán)境培養(yǎng)48 h，血鏈球菌復(fù)蘇后于37℃下微需氧環(huán)境培養(yǎng)24 h。抽取菌落革蘭染色后進(jìn)行生化鑒定，確認(rèn)為純菌無(wú)污染后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，配制成2.0×106CFU/mL 菌懸液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC） 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，調(diào)整抗菌肽RISE-AP12?濃度為40、35、30、25、20、15、10、5、2.5 mg/L。各取100 μL 菌懸液與藥液接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)觀察。置于黑色背景中，若肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)孔清亮且對(duì)應(yīng)的最小用藥濃度時(shí)即為MIC 值；當(dāng)菌落數(shù)少于5～6 個(gè)時(shí)對(duì)應(yīng)的最低濃度即為MBC 值[9]。進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 kill-time 曲線測(cè)定與繪制 菌液與藥液1∶1混合后，取50 μL 用三蒸水稀釋10 倍，取稀釋后的25 μL 進(jìn)行涂布，置于專(zhuān)性厭氧環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。分別檢測(cè)1、2 MIC 濃度時(shí)的抑菌效果。選取BHI 培養(yǎng)基+菌懸液為陰性對(duì)照，選取BHI 培養(yǎng)基+復(fù)方氯己定漱口液作為陽(yáng)性對(duì)照。以log CFU/mL 為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，進(jìn)行kill-time 曲線的繪制。進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 生物膜制備及分組 將鈦片切割研磨后，用無(wú)水乙醇與去離子水超聲20 min，超聲微弧氧化后，經(jīng)3 mol/L 的NaOH 處理，于60℃浸泡1 h，晾干。調(diào)節(jié)pH 至7 時(shí)，使用KH-550 硅烷聯(lián)劑超聲，再浸入硅烷溶液中浸泡30 s，干燥后待用。收集口腔狀況良好、無(wú)吸煙史且近期未服用藥物的10 名志愿者唾液，男性5 名，女性5 名，平均年齡（40.6±1.6）歲，以4 500 r/min 離心30 min 后取上清液，過(guò)濾除菌后備用。將鈦片消毒后置于唾液中24 h，形成膜后，轉(zhuǎn)至24 孔板培養(yǎng)，加入500 μL 菌液、1 500 μL 培養(yǎng)基，于相應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)24～48 h。PBS 沖洗3 次后于戊二醛固定24 h，采用梯度酒精洗脫。取出制備的生物膜置于24 孔板中，分別加入40、20、10、5、2.5 mg/L 的抗菌肽RISE-AP12?、無(wú)菌生理鹽水與0.6 g/L 復(fù)方氯己定漱口液的培養(yǎng)基1 000 μL，制備生物膜。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm 處的OD 值。生物膜清除率=（藥物處理后OD 值-無(wú)菌生理鹽水OD 值）/無(wú)菌生理鹽水OD 值×100%。進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)本次研究的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s 表示，采用單因素方差分析，兩兩比較應(yīng)用LSD-t 檢驗(yàn)方法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)主要致病菌的影響 根據(jù)MIC 和MBC 定義，判定各致病菌的MIC 和MBC，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)主要致病菌的影響Tab 1 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12 ? on main pathogenic bacteria

2.2 抗菌肽RISE-AP12?作用種植體周?chē)字饕虏【膋ill-time 曲線 kill-time 曲線發(fā)現(xiàn)，在1 MIC 和2 MIC 時(shí)均具有較好的殺菌作用，2 MIC的抑菌作用顯著強(qiáng)于1 MIC 與陽(yáng)性對(duì)照組（具核梭桿菌：t=1.653、1.763，P=0.013、0.008；牙齦卟啉單細(xì)胞菌：t=0.984、1.271，P=0.005、0.007；血鏈球菌：t=1.548、2.187，P=0.023、0.002），見(jiàn)圖1～3。

圖1 抗菌肽RISE-AP12?作用具核梭桿菌的kill-time 曲線Fig 1 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12? on Fusobacterium nucleatum

2.3 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)鈦種植體周?chē)字饕虏【锬さ挠绊?隨著抗菌肽RISE-AP12?的濃度增加，其對(duì)具核梭桿菌、牙齦卟啉單細(xì)胞菌、血鏈球菌生物膜的清除率也隨之增強(qiáng)。當(dāng)抗菌肽RISE-AP12?濃度為40 mg/L 時(shí)，對(duì)生物膜的抑制作用最強(qiáng)，清除率顯著高于0.6 g/L 復(fù)方氯己定漱口液組（具核梭桿菌：t=2.768，P=0.032；牙齦卟啉單細(xì)胞菌：t=0.676，P=0.014；血鏈球菌：t=0.794，P=0.025），見(jiàn)圖4～6。

圖2 抗菌肽RISE-AP12?作用牙齦卟啉單細(xì)胞菌的kill-time 曲線Fig 2 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Porphyromonasgingivalis

圖3 抗菌肽RISE-AP12?作用血鏈球菌的kill-time 曲線Fig 3 Kill-time curve of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Streptococcus sanguis

圖4 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)具核梭桿菌生物膜的影響Fig 4 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Fusobacterium nucleatum biofilm

圖5 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)牙齦卟啉單細(xì)胞菌生物膜的影響Fig 5 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Porphyromonasgingivalis biofilm

圖6 抗菌肽RISE-AP12?對(duì)血鏈球菌生物膜的影響Fig 6 Effect of antimicrobial peptide RISE-AP12?on Streptococcus sanguis biofilm

3 討論

隨著種植體的使用量不斷增加，種植體周?chē)滓沧兊迷絹?lái)越普遍，關(guān)于種植體周?chē)椎牟∫驅(qū)W研究越來(lái)越受到專(zhuān)家學(xué)者的關(guān)注[10]。最先認(rèn)為種植體周?chē)装l(fā)生的原因在于從力學(xué)角度出發(fā)，認(rèn)為植入體不能很好負(fù)荷咀嚼帶來(lái)的外力。但是隨著研究不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)減少力學(xué)因素的影響后并不能減少種植體周?chē)椎陌l(fā)生。種植體周?chē)资锹园l(fā)展的過(guò)程，骨質(zhì)進(jìn)行性破壞，在其發(fā)展過(guò)程中，菌斑的聚集以及生物膜內(nèi)部復(fù)雜的相互關(guān)系與宿主炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展密不可分，因此細(xì)菌菌落的研究變得越來(lái)越熱門(mén)[11]。其中，具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌、厭氧菌及螺旋體、福賽坦菌、齒垢密螺旋體等被認(rèn)為是與種植體周?chē)装l(fā)生最為密切的菌落[12]。在上述眾多的細(xì)菌庫(kù)中，血鏈球菌是最早定植于牙面的一種細(xì)菌，在齦上和齦下菌斑中都可檢出，可以與多種細(xì)菌發(fā)生聚集反應(yīng)[13]。具核梭桿菌是口腔中常見(jiàn)共生細(xì)菌，在生物膜中具有共聚反應(yīng)，可通過(guò)黏附素對(duì)各個(gè)時(shí)期細(xì)菌的定植進(jìn)行整合[14]。牙齦卟啉單胞菌是導(dǎo)致種植體周?chē)椎闹饕虏【?，其齦下的定植需要早期定植菌的存在，如鏈球菌等。其侵入宿主后可以改變自身基因，抑制中性粒細(xì)胞活性，參與生物膜的形成和宿主防御的調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是重點(diǎn)研究的細(xì)菌病原體[15]。因此，選擇上述3 種菌種作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽RISE-AP12?對(duì)具核梭桿菌的MIC 值最低；對(duì)牙齦卟啉單細(xì)胞菌的MBC 值最低；而對(duì)血鏈球菌的抑制、殺菌作用相對(duì)較弱，這可能是由于血鏈球菌具有雙重特性，其代謝產(chǎn)物對(duì)厭氧菌可產(chǎn)生拮抗作用，其MIC、MBC 值最高，分別為20、35 mg/L。一般抗菌藥物可呈時(shí)間依賴性或濃度依賴性具有殺菌或抑菌作用，本研究進(jìn)一步繪制抗菌肽RISE-AP12?作用的時(shí)間殺菌曲線。根據(jù)抗菌肽RISE-AP12?作用于具核梭桿菌、牙齦卟啉單細(xì)胞菌與血鏈球菌的kill-time 曲線發(fā)現(xiàn)，在1 MIC和2 MIC 時(shí)均具有較好的殺菌作用，2 MIC 的抑菌作用顯著強(qiáng)于1 MIC 與陽(yáng)性對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。較高濃度的抗菌肽RISE-AP12?抑菌作用更強(qiáng)。值得注意的是，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，抗菌效果并沒(méi)有持續(xù)增長(zhǎng)，表明抗菌肽的抗菌作用可能為劑量依賴性，而非時(shí)間依賴性。

細(xì)菌生物被膜是指細(xì)菌相互黏附于接觸表面，通過(guò)分泌的因子將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[16]。細(xì)菌生物被膜中的細(xì)菌可以采用多種生存策略來(lái)逃避宿主的防御，并且擁有著維系共生制衡關(guān)系的各種因子，抗菌素想摧毀這樣的微生態(tài)是相當(dāng)有難度的[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽RISE-AP12?的濃度增加，其對(duì)具核梭桿菌、牙齦卟啉單細(xì)胞菌、血鏈球菌生物膜的清除率也隨之增強(qiáng)，顯示出較好的抗菌作用。當(dāng)抗菌肽RISEAP12?濃度為40 mg/L 時(shí)，對(duì)生物膜的抑制作用最強(qiáng)，清除率顯著高于0.6 g/L 復(fù)方氯己定漱口液組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的作用機(jī)制仍不完全清楚。目前提出有孔洞學(xué)說(shuō)（the barrel-stave model）、可變“毯”學(xué)說(shuō)（the carpet model）、離子通道學(xué)說(shuō)（the aggregate channel model）。此外，還有很多研究認(rèn)為，抗菌肽對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的作用僅是開(kāi)始，很多抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用都伴隨著細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng)。很多抗菌肽都能穿過(guò)細(xì)菌生物膜，分別與細(xì)胞內(nèi)不同組織結(jié)合，產(chǎn)生破壞作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)于細(xì)菌的抑制作用。目前對(duì)于抗菌肽RISE-AP12?來(lái)說(shuō)，雖得知其有一定抗菌作用，但是其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，抗菌肽RISE-AP12?可以抑制鈦種植體周?chē)字饕虏【咚蠛藯U菌、血鏈球菌以及牙齦卟啉單胞菌生長(zhǎng)，同時(shí)可以抑制生物膜生長(zhǎng)，從而控制鈦種植體周?chē)椎陌l(fā)生。