劉洋，李嘉民，陳榮，張祥建

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300350；2.石家莊市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，石家莊 050000）

近年來，腦卒中已是我國位列第一的致死性疾 病，并給我國社會、經(jīng)濟帶來了巨大負擔[1]。隨著血管再通技術的開展，血管開通同時帶來了興奮毒性、炎癥、氧化應激等一系列級聯(lián)反應，所致的血腦屏障破壞和腦水腫的形成是最終腦卒中致殘的兩個重要因素，與患者的預后息息相關[2]。血腦屏障功能紊亂是存在于許多神經(jīng)系統(tǒng)疾患的病理特點，在其各個病理變化過程中起關鍵作用[3]。而緊密連接蛋白又是維持血腦屏障滲透特性的主要結構。許多研究已表明，白藜蘆醇苷具有多方面的神經(jīng)保護作用[4]。而在腦缺血再灌注損傷后血腦屏障滲透性、緊密連接蛋白的保護方面研究還較少。本研究通過應用白藜蘆醇苷干預小鼠腦缺血再灌注損傷模型的方法，探究其對損傷后的血腦屏障的保護作用及對緊密連接蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性CD1 小鼠（25～30 g）共102 只，周齡4～6 周（北京維通利華有限公司），恒溫19～25℃飼養(yǎng)，12 h 光照/12 h 黑暗，供應純凈水及標準飼料。

1.2 主要試劑、藥物及儀器 伊文思藍（Biotopped公司，中國），兔抗小鼠Claudin-5 抗體（Abcam 公司，英國），兔抗小鼠Occludin 抗體（Abcam 公司，英國），兔抗小鼠ZO-1 抗體（GeneTex 公司，美國），兔抗小鼠GAPDH 抗體（bioworld 公司，美國），熒光標記羊抗兔二抗（Rockland 有限公司，美國），大鼠抗小鼠CD-31 抗體（BD 公司，美國），熒光標記驢抗大鼠488（康為世紀生物工程公司，德國），熒光標記驢抗兔594（康為世紀生物工程公司，德國），白藜蘆醇苷（生理鹽水配至3 mg/mL、6 mg/mL）（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，中國），恒溫干燥箱（泰斯特儀器有限公司，中國），熒光顯微鏡（蔡司公司，德國），多功能酶標儀（Bio-Tek 公司，美國）。

1.3 模型的建立及給藥方式 參照Longa 法[5]制作小鼠單側短暫性大腦中動脈閉塞（tMCAO）模型。將小鼠麻醉后仰臥固定，頸正中縱切口，逐層分離頸部各動脈，夾閉頸內(nèi)動脈，將頸外動脈遠端結扎，離斷遠心端，于頸外動脈剪口，將線栓輕柔插入，經(jīng)頸內(nèi)動脈至大腦中動脈起始處，遇阻力感即停止。1 h后取出線栓，結扎頸外動脈殘端，逐層縫合。應用多普勒于術中監(jiān)測大腦中動脈供血區(qū)的血流變化，血流隨線栓插入下降，拔出線栓后恢復，說明模型成功。假手術組手術步驟與tMCAO 組一致，不插入線栓。

各組將配制好的白藜蘆醇苷和溶劑分別于缺血即刻腹腔注射給藥。

1.4 實驗動物分組 將實驗動物隨機分成4 組：假手術組（Sham 組，等體積生理鹽水，28 只），缺血再灌注組（tMCAO+等體積生理鹽水，28 只），白藜蘆醇苷低劑量組（tMCAO+白藜蘆醇苷30 mg/kg，18 只），白藜蘆醇苷高劑量組（tMCAO+白藜蘆醇苷60 mg/kg，28 只）。

實驗共使用102 只小鼠。其中，行為學評分共4 組，每組18 只，依據(jù)行為學評分結果在白藜蘆醇苷兩個劑量中選擇其一（高劑量組）進行下面的實驗。該部分小鼠繼續(xù)完成腦梗死體積測定（n=18，共3 組，每組6 只），腦組織水含量測定（n=18，共3組，每組6 只），伊文思藍染色（n=18，共3 組，每組6 只）。另外，Western 印跡共3組，每組6 只；免疫熒光檢測共3 組，每組4 只。

1.5 行為學評分 應用改良的Longa 評分法在各組造模后24 h 分別進行神經(jīng)功能缺損評價。評分標準：0 分：提示無神經(jīng)功能缺損。1 分：輕度神經(jīng)功能缺損——不能完全伸展前爪。2 分：中度神經(jīng)功能缺損——向病損側轉圈。3 分：重度神經(jīng)功能缺損——向病損側跌倒。4 分：不可自主行走，意識喪失。

1.6 腦梗死體積測定 提取完整腦組織，將嗅球切除后放入模具，連續(xù)切出2 mm 厚腦片（共5 片），浸泡于37℃恒溫2% TTC 溶液中，孵育10 min 后于4%多聚甲醛中固定24 h，拍照并使用ImageJ 1.47v軟件進行圖像分析，計算梗死體積百分比：梗死體積百分比（%）={[總梗死體積-（梗死側半球體積-梗死對側半球體積）]/梗死對側半球體積}×100%。

1.7 腦組織水含量測定 取從額極向后第3 mm至7 mm 皮層腦組織，將右側腦組織錫紙包裹稱得梗死側濕重，同樣方式得到梗死對側濕重。200℃烤箱烘干10 h，稱得雙側干重。計算腦組織含水量:（腦組織濕重-腦組織干重）/濕重×100%。

1.8 伊文思藍染色 造模給藥后即刻經(jīng)腹腔注射2%伊文思藍（4 mL/kg），24 h 后心臟灌注，取腦測重，應用50%三氯乙酸溶液按1.5 mL/g 腦組織進行組織勻漿。以3 000 r/min 離心20 min，用酶標儀在620 nm 下測定上清液的吸光度。

1.9 Western 印 跡 檢 測 皮 層ZO -1、Occludin、Claudin-5 蛋白的表達 提取蛋白后，經(jīng)上樣、電泳、轉膜、封閉，加入封閉液稀釋的一抗（兔抗ZO-1，1:500，兔抗Occludin，1∶20 000；兔抗Claudin-5，1:1 000；兔抗GAPDH，1∶10 000），4℃搖床過夜，洗滌，加入二抗（1:10 000），室溫下避光震蕩1 h、洗滌后圖像掃描分析。

1.10 免疫熒光檢測CD-31、ZO-1、Claudin-5 心臟灌注后取腦用冰凍切片機切取25 μm 腦片。經(jīng)復溫、漂洗、打孔、封閉，兔抗小鼠ZO-1 抗體（1∶200）、兔抗小鼠Claudin-5 抗體（1:200）分別與大鼠抗小鼠CD-31 抗體（1∶500）混合滴加，4℃孵育過夜。漂洗后用Dylight594 驢抗兔熒光二抗和Dylight488 驢抗大鼠熒光二抗混滴，37℃孵育2 h，10 μg/mL Hochest搖床孵育15 min，抗熒光衰減劑封片。應用熒光顯微鏡觀察。

1.11 統(tǒng)計學處理 使用SPSS21.0 進行數(shù)據(jù)處理。非正態(tài)分布的計量資料應用非參數(shù)秩和檢驗。符合正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，采用方差分析（one-way ANOVA）進行比較。檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇苷對行為學評分的影響 造模24 h與缺血再灌注組相比，白藜蘆醇苷高劑量組的行為學評分得到顯著改善（Z=-2.506，P＜0.05）。白藜蘆醇苷低劑量組的行為學評分低于缺血再灌注組，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖1。據(jù)此，筆者選擇高劑量組（60 mg/kg）作為白藜蘆醇苷干預組進行實驗及討論。

圖1 各組行為學評分比較Fig 1 Comparison of neurological deficit score in each group

2.2 白藜蘆醇苷的干預降低了腦梗死體積 與缺血再灌注組相比，術后24 h 白藜蘆醇苷組顯著降低了梗死體積，具有統(tǒng)計學意義[（33.76%±13.27%）vs.（57.47%±9.53%），t=3.555，P＜0.05]，見圖2。

圖2 各組腦梗死體積比較Fig 2 Comparison of infarct volume in each group

2.3 白藜蘆醇苷組減輕了腦組織含水量 利用干濕重法于術后24 h 檢測小鼠病灶側半球腦含水量：白藜蘆醇苷組含水量小于缺血再灌注組，差異具有顯著性[（75.62%±7.95%）vs.（85.72%±6.20%），t=2.456，P＜0.05]，見圖3。

圖3 各組腦組織含水量比較Fig 3 Comparison of brain water content in each group

2.4 白藜蘆醇苷降低了伊文思藍的滲出 白藜蘆醇苷干預后的腦組織伊文思藍滲出量明顯減低，較缺血再灌注組差異有統(tǒng)計學意義[（1.49±0.47）vs.（2.13±0.44），F(xiàn)=5.978，P＜0.05]，見圖4。

圖4 各組伊文思藍滲出程度比較Fig 4 Comparison of leakage of evans blue in each group

2.5 白藜蘆醇苷對緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達水平的影響 與假手術組相比，缺血再灌注組及白藜蘆醇苷組緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達均有降低，而白藜蘆醇苷組相較缺血再灌注組有顯著的上調(diào)（F 值分別為7.576、16.378、6.527，均P＜0.05），見圖5。

圖5 各組緊密連接蛋白表達水平比較Fig 5 Comparison of expression of tight junction proteins in each group

2.6 白藜蘆醇苷對內(nèi)皮細胞CD-31、緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5 表達分布的影響 免疫熒光顯示：在皮層缺血半暗帶區(qū)，白藜蘆醇苷組CD-31 的表達有所增加，可見相對光滑、連續(xù)的微血管形態(tài)；缺血再灌注組微血管形態(tài)相對曲折、破碎，有明顯的結構破壞（圖6）。與CD-31 共標的ZO-1、Claudin-5分布于血管內(nèi)皮細胞的周圍，在假手術組中可見連續(xù)、索條狀分布。在皮層缺血半暗帶區(qū)，白藜蘆醇苷明顯減輕了緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-5 的破壞程度（圖7、8）。

圖6 白藜蘆醇苷改善了內(nèi)皮細胞標志物CD-31（綠色熒光標記）的破壞程度Fig 6 The injury of CD-31 representing the endothelial cells（green）alleviated in PD group

圖7 白藜蘆醇苷組改善了緊密連接蛋白ZO-1 的破壞程度Fig 7 The degradation of tight junction proteins ZO-1 alleviated in by PD group

圖8 白藜蘆醇苷組可以改善了緊密連接蛋白Claudin-5 的破壞程度Fig 8 The degradation of tight junction proteins Claudin-5 alleviated in byPD group

3 討論

從我國傳統(tǒng)中藥虎杖的根莖中提取的白藜蘆醇苷，是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產(chǎn)物[6]，是存在于自然界中最多的一種白藜蘆醇化學形式[7]。近年來，大量研究表明白藜蘆醇苷在保護神經(jīng)細胞[4]、改善記憶[8]、抗炎[9]、抗氧化[10]、抗凋亡[11]等方面均有著一定作用。已有研究證明：在梗死后大腦皮層中白藜蘆醇苷上調(diào)膠質瘤相關癌基因同源蛋白1（Gli1）、跨膜蛋白受體1（Ptch1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）和Claudin-5 的表達水平及降低核因子-κB（NFκB）的表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[12]。在腦缺血再灌注損傷中，白藜蘆醇苷抑制細胞黏附分子（CAMs）包括細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等的表達，以發(fā)揮其保護作用[13]。另有研究表明，白藜蘆醇苷可能通過激活CCAAT-增強子結合蛋白β（C/EBPβ）/肺腺癌轉移相關轉錄因子1（MALAT1）/cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）/過氧化物酶增殖激活受體γ 協(xié)同激活因子-1α（PGC-1α）/過氧化物酶增殖激活受體γ（PPARγ）通路，同時抑制腦缺血后炎癥因子的表達發(fā)揮對缺血后內(nèi)皮細胞及血腦屏障的保護作用[14]。本研究中，在小鼠腦缺血再灌注損傷后行為學評分的改善、腦梗死體積的降低、腦水腫的減輕等方面，展現(xiàn)了白藜蘆醇苷腦保護、改善梗死體積及水腫程度方面的作用。

作為血腦屏障維持通透性最主要的結構基礎，緊密連接蛋白起到了重要作用[15]。其中，Claudin-5是維持血腦屏障功能的關鍵蛋白，在血腦屏障細胞旁途徑的通透性方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，它的破壞是很多疾病病理變化中破壞血腦屏障完整性的開端[16]。Occludin 是緊密連接蛋白中調(diào)節(jié)血腦屏障完整性和通透性的跨膜蛋白，受很多因素的調(diào)節(jié)，包括基質金屬蛋白酶（MMP）的破壞、磷酸化和非磷酸化的轉變、泛素化及其他細胞因子的影響。Occludin 的調(diào)節(jié)機制包括NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶C（PKC）、Rho 激酶（RhoK）以及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）等很多不同的通路，Occludin 的降解被認為是卒中后腦水腫及出血性轉化的驅動因素[17]。ZO-1 為胞質附著蛋白中的核心環(huán)節(jié)，維系著內(nèi)皮細胞間連接的空間編排和張力、肌球蛋白的活性、屏障滲透性和屏障的形成[18]。本實驗中通過白藜蘆醇苷的干預，觀察到缺血再灌注損傷后伊文思藍滲出的改善，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、CD-31 表達的上調(diào)，以及血管形態(tài)完整性的改善，均提示白藜蘆醇苷在血腦屏障通透性、完整性的保護方面具有顯著作用。

血腦屏障的破壞在缺血再灌注損傷后涵蓋了兩個連續(xù)的時相[19]。第一個高峰出現(xiàn)在3～6 h，此時血腦屏障開放，被活化的MMP-2 在血腦屏障的破壞中起到關鍵作用。接下來出現(xiàn)的第二高峰（第24～48 小時）中，活化的MMP-3、MMP-9 開始發(fā)揮其生物學效應，細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β 等在NF-κB 的激活下，進一步誘發(fā)MMP-3、MMP-9 升高其表達水平。由此產(chǎn)生的氧化應激可破壞內(nèi)皮細胞，進而引起血管源性水腫，加劇腦組織的破壞。在缺血再灌注損傷的病理過程中，MMPs 扮演了重要角色，在血腦屏障破壞開放的兩個時相中均有參與，包括起始階段可逆性時相中被激活的MMP-2 以及第二時相里發(fā)揮主要作用的MMP-3、MMP-9[20]。

現(xiàn)有的研究顯示，白藜蘆醇苷能夠通過降低NF-κB[12]，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6[9]等炎癥因子的表達。TNF-α 能夠通過刺激連接黏附分子-1（JAM-1）的再分布，將發(fā)揮功能的細胞轉移至細胞的管腔面[21]。IL-1β 能夠通過破壞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 來增加血腦屏障的滲透性[22]。炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 不僅能夠發(fā)揮自身作用加劇細胞間的通透性[23]，而且可以激活NF-κB，誘發(fā)MMP-3、MMP-9 的表達增加以破壞緊密連接蛋白，最終使血腦屏障的完整性破壞。而ICAM-1、VCAM-1 的表達能夠被白藜蘆醇苷抑制[13]，從而減輕ICAM-1、VCAM-1 加強炎癥細胞聚集的作用，減輕腦梗死后炎癥對血腦屏障完整性、通透性的影響。而白藜蘆醇苷的抗氧化應激、抗凋亡作用[24]，同樣可能是其發(fā)揮保護緊密連接蛋白作用的潛在機制。