侯維納，呂愛婷，孫琪青，馮迎軍

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南省兒童醫(yī)院，鄭州兒童醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000）

心臟肥大是對(duì)重度壓力的生理反應(yīng)，可使心臟功能恢復(fù)正常[1]。心肌細(xì)胞持續(xù)增大需要更多的氧氣，而冠狀動(dòng)脈的血液供應(yīng)不足，可導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死[2]。盡管越來越多的文獻(xiàn)研究了調(diào)節(jié)心臟肥大的分子靶點(diǎn)，但其詳細(xì)的分子機(jī)制尚未全面了解。

MicroRNA（miRNA）是約19～25 個(gè)核苷酸的保守非編碼單鏈RNA，它們通過與靶mRNA 的3′UTR結(jié)合來抑制翻譯和（或）降解靶mRNA[3]。miRNA 通過調(diào)節(jié)其靶基因參與多種生物過程，如增殖、分化、凋亡、發(fā)育、血管生成和免疫應(yīng)答[4]。如miR-142-3p是調(diào)節(jié)心臟中早期胚胎干細(xì)胞分化的重要因素，并且對(duì)心臟發(fā)育具有負(fù)面調(diào)節(jié)作用[5]。Roberto 等[6]發(fā)現(xiàn)MIR-138-5p 表達(dá)與骨肉瘤的預(yù)后有關(guān)；然而MIR-138-5p 在心肌肥大模型大鼠及心肌細(xì)胞中表達(dá)如何，發(fā)揮何作用尚不清楚。本研究通過成功構(gòu)建壓力超負(fù)荷心肌肥大大鼠模型（TAC）和心臟肥大體外模型，探究MIR-138-5p 在肥大心肌細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)心臟肥大反應(yīng)的作用及其初步機(jī)制，希望基于MIR-138-5p 的分子機(jī)制為改善心臟肥大提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 TAC 的建立 所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)均根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》（NIH 出版物，2011 年修訂）和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。從鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK（豫）2017－0001] 購買了6 周齡的成年雄性Sprague-Dawley 鼠，體重約200～250 g，共20 只，每組10 只。根據(jù)以前文獻(xiàn)，進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)。用水合氯醛（350 mg/kg，腹膜內(nèi)）麻醉大鼠，開胸后，用彎頭眼科鑷輕柔分離腹主動(dòng)脈，橫貫腹主動(dòng)脈，然后用26 號(hào)針頭將6-0 絲線縫合在主動(dòng)脈周圍，導(dǎo)致主動(dòng)脈腔部分狹窄。在假手術(shù)組中，除沒有主動(dòng)脈縫合，其余步驟與TAC 手術(shù)相同。然后將實(shí)驗(yàn)分為2 組，即主動(dòng)脈縮窄組（AB）和假手術(shù)組（Sham）。

1.2 組織病理學(xué) 分析手術(shù)切除左心室組織，在10%福爾馬林緩沖液中固定，石蠟包埋，切成5 μm 厚的切片。用蘇木精-曙紅染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)方案 將大鼠H9c2 心肌細(xì)胞（中國科學(xué)院，上海，中國）接種到含有10%胎牛血清（HyClone，South Logan，UT）的Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（Invitrogen，Carlsbad，CA）中，放置在37℃和5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。為了構(gòu)建體外心臟肥大模型，將H9c2 細(xì)胞用濃度為1.0 mmol/L 的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ，Sigma-Aldrich.St.Louis，MI）處理24 h，將細(xì)胞分為Con 組和AngⅡ組。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)制造商說明書，使用TRIzol 試劑（Life.Technologies，Carlsbad，CA）從樣品中提取總RNA；cDNA 合成后（All-in-One First-Strand cDNA Synthesis 試劑盒，GeneCopoeia Inc，Santa Cruz，CA），使用MIR-138-5p 對(duì)應(yīng)的引物，在ABI 75 00HT 系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）上使用All-in-One qPCR Mix（GeneCopoeiaInc，USA）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）；β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照，進(jìn)行重復(fù)反應(yīng)對(duì)于每個(gè)樣品，使用2-ΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)的相對(duì)變化；每個(gè)實(shí)驗(yàn)的所有樣品一式兩份進(jìn)行。

1.5 MIR-138-5p 的過表達(dá) 基因過表達(dá)質(zhì)粒，包括pcDNA3.1/CCCTC 結(jié)合因子（CTCF）、pcDNA3.1/SNHG16、pcDNA3.1/IGF1 和相對(duì)陰性對(duì)照（NC，pcDNA3.1）以及MIR-183-5p 模擬物（miR-mimic）和對(duì)照模擬物（miR-NC）均購自上?；蛑扑帲ㄖ袊?。將大鼠H9c2 心肌細(xì)胞接種在6 孔板中，使用補(bǔ)充有10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。使 用Opti-MEM Reduced Serum Medium（Gibco，Carlsbad，CA，USA）在第2 天當(dāng)細(xì)胞豐度約60%～70%時(shí)，每個(gè)孔加入等量（200 nmol/L）的miR-mimic和miR -NC， 用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6 h 后，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充有2% FBS 的RPMI 1640，轉(zhuǎn)染48 h 后，用AngⅡ處理細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞，并通過定量RTPCR 或蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行分析，將細(xì)胞分為Con 組（生理鹽水+生理鹽水）、AngⅡ組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理鹽水）、AngⅡ+ miR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+ MIR-138-5pmimic 組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p- mimic），共4 組。

1.6 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建 靶向大鼠組蛋白去乙酰化酶（HDAC）4cDNA 的siRNA 序列由GenePharma設(shè)計(jì)和合成。siRNA 序列如下：5′-GCGGAAAUGUUAAGAGAUU-3′，合并亂序的siRNA 作為陰性對(duì)照。 編碼不含miR-138-5p 響應(yīng)性3′-UTR 的全長(zhǎng)人HDAC4 cDNA 開放閱讀框（ORF）的哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒購自Invitrogen。空質(zhì)粒用作陰性對(duì)照。根據(jù)制造商的說明書，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），將NC+pcDNA-Con、miR-138-5p-mimic+pcDNA-Con 和miR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4（Sino Biological Inc.）共轉(zhuǎn)染大鼠H9c2 心肌細(xì)胞。將細(xì)胞分為Con 組（生理鹽水+生理鹽水）、AngⅡ組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+生理鹽水）、AngⅡ+ MIR-NC（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-NC）、AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic）和AngⅡ+ MIR-138-5p- mimic+ pcDNA- HDAC4（1.0 mmol/L 的AngⅡ+200 nmol/L MIR-138-5p-mimic+pcDNA-HDAC4 混合物）組，共5 組。

1.7 熒光素酶活性測(cè)定 通過PCR 擴(kuò)增HDAC4基因的3′UTR 區(qū)段并插入載體中。使用Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）產(chǎn) 生破壞HDAC4 3′UTR 區(qū)域的miR-138-5p 結(jié)合位點(diǎn)的突變構(gòu)建體。使用Lipofectamine 200（Invitrogen）將具有miR-138-5p 模擬物的HDAC4 3′UTR或mut-HDAC4 3′UTR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h 后，通過雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega）分析熒光素酶活性。

1.8 免疫熒光（IF）染色 首先將固定在4%甲醛中的心肌細(xì)胞在0.1%Triton X-100 中滲透45 min，然后在4℃下用α-actinin 抗體（Abcam，Cambridge，UK）處理過夜。與二抗孵育1 h 后，將H9c2 細(xì)胞在4′，6-二mid 基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液中培養(yǎng)，然后通過熒光顯微鏡（Carl Zeiss，Dublin，CA）進(jìn)行IF捕獲，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行細(xì)胞表面積測(cè)量。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 遍。

1.9 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡 根據(jù)制造商的說明，使用RIPA 裂解緩沖液（Beyotime，Shanghai，China）從培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中提取總蛋白。收集上清液，用Pierce BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。然后，通過10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。在室溫下用5%脫脂乳封閉1 h后，將膜用一抗在4℃下免疫染色過夜，在TBST 中洗滌3 次，然后在室溫下與辣根過氧化物酶-標(biāo)記的二抗（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）孵育1 h。用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑（Cell Signaling Technology Inc.，USA）檢測(cè)條帶信號(hào)。通過用GAPDH 抗體探測(cè)相同的印跡來標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)水平。一抗購自以下來源：anti-ANF、anti-BNP、anti-β-MHC 及anti-GAPDH（Santa Cruz，CA，USA）;使用image J 軟件掃描和量化每個(gè)條帶的強(qiáng)度。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 遍。

2 結(jié)果

2.1 MIR-138-5p 在壓力負(fù)荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表達(dá) 建立AngⅡ誘導(dǎo)的原發(fā)性心肌肥大和TAC 大鼠模型。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，AB組大鼠的心臟體積以及心臟橫截面積明顯增大（圖1A），且心肌細(xì)胞中MIR-138-5p 的mRNA 水平均明顯下降（圖1B，F(xiàn)=21.578，P＜0.001）；相對(duì)于Con 組，AngⅡ組細(xì)胞表面積明顯增大（圖1C）;且心肌細(xì)胞中miR-138-5p 的mRNA 水平均明顯下降（圖1D，F(xiàn)=23.790，P＜0.001）。

圖1 MIR-138-5p 在壓力負(fù)荷和AngⅡ引起的心肌肥大中的表達(dá)情況Fig 1 The expression of MIR-138-5p in myocardial hypertrophy caused by pressure overload and AngⅡ

2.2 MIR-138-5p 過表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的的心肌肥大的影響 本實(shí)驗(yàn)通過α-肌動(dòng)蛋白染色和Western印跡評(píng)估了各組心肌細(xì)胞的表面積心肌肥大標(biāo)志蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與AngⅡ+ miR-NC 組相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組心肌細(xì)胞中MIR-138-5p 表達(dá)明顯增加（圖2A）。與AngⅡ+MIR-NC組相比，AngⅡ+MIR-138-5p-mimic 組心肌細(xì)胞的表面積（圖2B）和心肌肥大標(biāo)志物表達(dá)均明顯下降（圖2D-F，F(xiàn)=9.532、11.199、8.125，均P＜0.01）。

圖2 MIR-138-5p 過表達(dá)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大的影響Fig 2 The effect of MIR-138-5p overexpression on Ang Ⅱ-induced cardiac hypertrophy

2.3 MIR-138-5p 與HDAC4 基因的靶點(diǎn)驗(yàn)證 結(jié)果顯示，在WT 組中，miR-mimic 組的HDAC4 相對(duì)熒光素酶活性比miR-NC 組顯著降低（圖3A，F(xiàn)=22.578，P＜0.001）；而Mut 組中，兩組的HDAC4 相對(duì)熒光素酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3A）。Western 印跡結(jié)果顯示：與NC 組相比，miR-mimic 組HDAC4 蛋白水平表達(dá)顯著下降（圖3B，F(xiàn)=25.530，P＜0.001）。

圖3 MIR-138-5p 與HDAC4 基因的靶點(diǎn)驗(yàn)證Fig 3 Target validation of MIR-138-5p and HDAC4 genes

2.4 miR-138-5p 通過靶向HDAC4 影響AngII 誘導(dǎo)的心肌肥大 本實(shí)驗(yàn)為了探究MIR-138-5p 抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大是否與HDAC4 表達(dá)有關(guān)，于是miR-138-5p 模擬物與HDAC4 共轉(zhuǎn)化為H9c2細(xì)胞系，檢測(cè)轉(zhuǎn)染HDAC4 后miR-138-5p 模擬物H9c2 細(xì)胞的表面積及心肌肥大標(biāo)志物的蛋白水平。結(jié)果顯示，與AngⅡ組相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic組心肌細(xì)胞表面積明顯減小，且其中心肌肥大標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯降低（F=24.634、23.214、23.734，均P＜0.001），見圖4；與AngⅡ+miR-138-5p-mimic 組相比，AngⅡ+miR-138-5p-mimic+pcDNA- HDAC4 組心肌細(xì)胞表面積明顯增大，且其中心肌肥大標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯升高（F=10.134，P＜0.01），見圖4。

圖4 miR-138-5p 通過靶向HDAC4 影響AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大Fig 4 miR-138-5p affects AngⅡ-induced cardiac hypertrophy by targeting HDAC4

3 討論

心肌肥大可有效補(bǔ)償心肌的重負(fù)荷。然而，心肌細(xì)胞持續(xù)增大可能導(dǎo)致心臟負(fù)擔(dān)過重，甚至有致死危險(xiǎn)[7-8]。已有研究發(fā)現(xiàn)，大量的miRNAs 在心臟肥大中發(fā)揮重要作用。例如，miR-142-3p 的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)線粒體功能，來改善心臟肥大[9]。然而，miR-138-5p 在心臟肥大中表達(dá)如何，發(fā)揮何作用及其分子機(jī)制尚未文獻(xiàn)報(bào)道。

在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)在壓力TAC 大鼠模型和AngⅡ誘導(dǎo)的心肌肥大模型中，miR-138-5p 的表達(dá)明顯下調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-138-5p 靶向NFIBSnail1 軸以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和化學(xué)耐藥性[10]，也已證明其可通過靶向survivin 來促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。然而，miRNA-138-5p 在心臟肥大中發(fā)揮何作用，尚不清楚。

為了探究miRNA-138-5p 對(duì)心臟肥大反應(yīng)的作用，將miRNA-138-5p-mimic 轉(zhuǎn)染到AngⅡ處理過的心肌細(xì)胞（H9c2），采用α-肌動(dòng)蛋白染色和蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測(cè)心肌細(xì)胞的表面積和心肌肥大標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，相對(duì)于AngⅡ+miRNC 組，AngⅡ+miR-138-5p-mimic 組心肌細(xì)胞的表面積和心肌肥大標(biāo)志蛋白，如心鈉素（ANP）、腦鈉肽（BNP）和β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）表達(dá)均明顯下降。這些發(fā)現(xiàn)表明，心肌細(xì)胞中miR-138-5p的過表達(dá)可以減弱心臟肥大反應(yīng)。

接下來，筆者采用TargetScan 在線軟件和熒光素酶測(cè)定法，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p 可以干擾HDAC4 的基因表達(dá)，且RT-PCR 結(jié)果也證實(shí)了HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。

組蛋白脫乙?；福℉DACs）通過使組蛋白乙?；蛎撘阴；瘉砜刂聘鞣N生物過程，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因啟動(dòng)子的可及性[12]。HDAC 分為4類：Ⅰ類HDAC（HDAC1、2、3 和8）、Ⅱ類HDAC（HDAC4、5、6、7、9 和10）、Ⅲ類HDAC（SIRT1-7）和Ⅳ類HDAC（HDAC11）[13]。有研究表明，HDAC4 可在多種組織中廣泛表達(dá)，尤其是在腦[14]、心臟和骨骼肌中。在小鼠中，HDAC4 可減輕由神經(jīng)支配引起的骨骼肌萎縮[15]。本研究已經(jīng)證實(shí)miR-138-5p 可抑制心臟肥大反應(yīng)，而且HDAC4 是miR-138-5p 的靶基因。但在心臟肥大反應(yīng)中，miR-138-5p 和HDAC4的關(guān)系如何尚不清楚。

因此，在本實(shí)驗(yàn)中，筆者將miR-138-5p 模擬物和HDAC4 共轉(zhuǎn)化到H9c2 心肌細(xì)胞系中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染HDAC4 后的miR-138-5p 模擬物H9c2 的表面積和心肌肥大標(biāo)志蛋白（如ANP、BNP 和β-MHC）水平。結(jié)果顯示：相對(duì)于AngⅡ組，AngⅡ+ miR-138-5pmimic 組心肌細(xì)胞表面積明顯減小，且其中心肌肥大標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯降低（圖4，F(xiàn)=24.634、23.214、23.734、均P＜0.001）；相對(duì)于AngⅡ+miR-138-5pmimic 組，Ang Ⅱ+miR-138-5p-mimic+pcDNAHDAC4 組心肌細(xì)胞表面積明顯增大，且其中心肌肥大標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯升高?？傊?，本數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明HDAC4 是miR-138-5p 的功能靶標(biāo)，在心臟肥大反應(yīng)中起重要作用。

綜上所述，miR-138-5p 通過抑制其靶基因HDAC4，抑制心臟肥大反應(yīng)，為臨床改善心臟肥大提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。