于海麗，陶偉杰，劉佳卉，單 虎，楊海燕，張傳美

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又稱豬藍(lán)耳病，主要引起豬繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)疾病[1]。繁殖障礙臨床表現(xiàn)為發(fā)情推遲，懷孕母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，存活下來(lái)的新生胎兒在出生3周之內(nèi)呈現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸癥狀，有時(shí)病死率接近100%[2]。豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus diseases，PCVD)是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wast ing，PMWS)、新生仔豬先天性震顫(Congenital tremors，CT)、母豬繁殖障礙(Sow abortion and mortality syndrome,SAMS)、皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome， PNDS)、豬呼吸疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex，PRDS)、相關(guān)性腸炎、增生性壞死肺炎等一系列具有明顯的臨床癥狀和病理變化疾病的統(tǒng)稱[3]。PRRSV和PCV2的感染還會(huì)造成豬只的免疫抑制，繼發(fā)其他病原體感染，從而加重病情，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失[4-5]。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)15 kb，至少包含10個(gè)開(kāi)放閱讀框，其中ORF5基因的變異情況在很大程度上可以反映PRRSV基因組的遺傳變異特征[6]。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是無(wú)囊膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的脊椎動(dòng)物病毒，PCV的ORF2中位于1 331 nt-1 339 nt的幾個(gè)堿基決定病毒的毒力。因此，PRRSV的ORF5基因和PCV的ORF2基因現(xiàn)廣泛用于系統(tǒng)進(jìn)化分析，是一個(gè)可以用來(lái)區(qū)分不同株群的合理方式。本文對(duì)山東省青島地區(qū)某養(yǎng)豬場(chǎng)PRRSV、PCV2混合感染病例進(jìn)行病原的檢測(cè)，并對(duì)PRRSV的ORF5基因和PCV2的ORF2基因進(jìn)行測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，確定病毒基因型，為發(fā)病豬群提供治療和免疫方向，也為豬群感染PRRSV和PCV2的科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 山東省青島地區(qū)某豬場(chǎng)飼養(yǎng)母豬60余頭，育肥豬200余頭，仔豬100余頭，近期頻繁出現(xiàn)仔豬死亡，于2020年12月送檢2頭發(fā)病仔豬到青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行診斷。剖檢并無(wú)菌采集發(fā)病仔豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等組織，用于后續(xù)細(xì)菌分離鑒定和病原檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；無(wú)菌輔酶Ⅰ(NAD)溶液，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Fetal Bovine Serum(FBS)，Biological Industries(BioInd)公司產(chǎn)品；One Step RT-PCR Kit(Dye Plus)試劑盒，諾唯贊生物科技(南京)有限公司產(chǎn)品；TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 高速冷凍離心機(jī)(V18R)，生命動(dòng)力亞洲有限公司產(chǎn)品；高通量組織研磨器(G200)，卡尤迪生物科技(北京)有限公司產(chǎn)品；凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR儀(T100)、電泳儀,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司產(chǎn)品；電子分析天平(FA2004)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(K8360)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定 無(wú)菌操作取肝臟、肺臟新鮮組織樣品，分別劃線接種到添加NAD和血清的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.2 病原PCR檢測(cè) 取剖檢豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體研磨后，使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒提取樣品核酸。以提取的核酸為模版，使用諾唯贊One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)試劑盒配制25 μL的反應(yīng)體系，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流感病毒(SIV)的相關(guān)片段(表1)；使用PremixTaqTMTaKaRaTaqTMVersion 2.0)試劑盒配制25 μL的反應(yīng)體系，通過(guò)PCR擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)的相關(guān)基因片段(表1)。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL于10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳(150 V，22 min)，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

表1 引物序列

1.2.3 PRRSV ORF5基因和PCV ORF2基因的克隆與測(cè)序分析 以提取的病毒核酸為模版，使用諾唯贊One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)試劑盒和PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0)試劑盒分別配制25 μL的反應(yīng)體系，擴(kuò)增PRRSV ORF5基因和PCV ORF2基因[7,11]。擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的片段產(chǎn)物，克隆于T載體后，由擎科生物公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線Blast比對(duì)分析。在GenBank中下載參考序列，使用MEGA7.0軟件對(duì)PRRSV的ORF5基因和PCV的ORF2基因分別做遺傳進(jìn)化分析，用ClustalW方法比對(duì)，用Neighbor-Joining方法基于遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果

2.1 主要臨床癥狀及發(fā)病情況

發(fā)病仔豬主要表現(xiàn)食欲減退，消瘦，被毛粗亂，呼吸困難，咳嗽等癥狀，隨后死亡，發(fā)病率約為50%，病死率約為20%。該場(chǎng)母豬常規(guī)免疫豬瘟、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病、口蹄疫等疫苗，截至發(fā)病前，仔豬已免疫過(guò)豬偽狂犬疫苗。發(fā)病后，畜主采取飼料中添加泰萬(wàn)菌素、對(duì)發(fā)病豬注射恩諾沙星和氟苯尼考的治療措施，但無(wú)明顯效果。

2.2 病理剖檢情況

剖檢發(fā)現(xiàn)，1號(hào)病豬的腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)水腫；心包積液、心肌內(nèi)膜出血；雙肺對(duì)稱性肉變、淤血；肺門(mén)淋巴結(jié)出血；喉頭及扁桃體正常；腹腔積液；肝、脾、腎臟正常。2號(hào)病豬的后軀、腹下皮膚紅紫；血凝不良；腹腔積液；心包內(nèi)呈現(xiàn)“絨毛心”，且有紅色積液；間質(zhì)性肺炎、肺淤血、肉變(圖1)；氣管內(nèi)有大量泡沫；雙腎被膜下有大量白色壞死點(diǎn)。

圖1 病理剖檢情況

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

2頭仔豬各組織樣品中均未分離到病原菌。

2.4 相關(guān)病原PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)病仔豬病料樣品中擴(kuò)增出PRRSV和PCV2的目的條帶(372 bp和785 bp)(圖2)，并將該陽(yáng)性毒株命名為PRRSV-1225和PCV2-1225。

M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.1號(hào)仔豬PCV；2.2號(hào)仔豬PCV；3.1號(hào)仔豬PRRSV；4.2號(hào)仔豬PRRSV；5.1號(hào)仔豬PRRSV ORF5

2.5 PRRSV ORF5基因和PCV ORF2基因的測(cè)序分析

在臨床樣品中擴(kuò)增出PRRSV ORF5基因的目的條帶(974 bp)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線Blast比對(duì)分析，所測(cè)序列與Blast上參考株(MN306077.1)相似度為95.33%。

從GenBank中選擇具有代表性的30株P(guān)RRSV毒株，其中1株荷蘭毒株、5株美國(guó)毒株和24株中國(guó)毒株[14]，30株參考毒株可分為兩大類型，即美洲型和以Lelystad virus毒株為代表的歐洲型。美洲型毒株又可以分為5個(gè)亞群，分別是以JXAI為代表的HP-PRRSV-like亞群，以VR-2332為代表的VR2332-like亞群，以CH-1a為代表的CH-1a-like亞群，以QYYZ為代表的QYYZ-like亞群，以NADC30為代表的NADC30-like亞群。對(duì)PRRSV-1225與參考毒株的ORF5基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示PRRSV-1225屬于NADC30-like亞群，與毒株WUH5親緣關(guān)系最近，同處一個(gè)亞群(圖3)。

圖3 基于PRRSV ORF5基因片段的遺傳進(jìn)化分析

在臨床樣品中擴(kuò)增出PCV2-1225的ORF2基因的目的條帶(785 bp)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線Blast比對(duì)分析，所測(cè)序列與Blast上參考株(MH341483.1)相似度為99.31%。從GenBank中選擇具有代表性的18株參考毒株，這些毒株可以分為PCV 2a、PCV 2b、PCV 2c、PCV 2d、PCV 2e基因型，將PCV2-1225毒株的ORF2與國(guó)內(nèi)外參考毒株的ORF2序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)[15]。結(jié)果顯示，PCV2-1225屬于PCV 2b基因型(圖4)。

圖4 基于PCV ORF2基因片段的遺傳進(jìn)化分析

3 討論

近年來(lái)，豬場(chǎng)疫病的情況日趨復(fù)雜，混合感染也越來(lái)越普遍，尤其是PRRSV、PCV混合感染最為嚴(yán)重[16]。PRRSV和PCV均屬于免疫抑制性病毒，豬群感染后免疫系統(tǒng)受損，免疫機(jī)能下降，二者的協(xié)同并發(fā)加重了豬免疫機(jī)能抑制的程度，易造成其他疫病的繼發(fā)感染，嚴(yán)重影響生豬生產(chǎn)[17]。本病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)雖未分離到病原菌，但不能完全排除無(wú)細(xì)菌感染，原因在于該豬場(chǎng)送樣前已經(jīng)進(jìn)行過(guò)一段時(shí)間抗菌藥物治療，在一定程度上抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)。根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢情況及PCR檢測(cè)結(jié)果，確定該豬場(chǎng)存在PRRSV和PCV2的混合感染。綜上所述，建議該豬場(chǎng)對(duì)病死豬進(jìn)行無(wú)害化處理，采取措施隔離發(fā)病母豬或仔豬，清除豬舍內(nèi)積糞，清除水槽、料槽中剩余食物、飲水，使用戊二醛或者次氯酸鈉等消毒劑進(jìn)行環(huán)境消毒。保證豬舍每日通風(fēng)、消毒，并做好豬群保暖工作。飼料內(nèi)加入替米考星、泰萬(wàn)菌素，連續(xù)投藥10 d；短期內(nèi)不引種以控制PRRSV在豬場(chǎng)內(nèi)的擴(kuò)散。按要求全群免疫接種PCV2疫苗，及時(shí)淘汰弱仔豬以控制PCV2在豬場(chǎng)內(nèi)的擴(kuò)散。1個(gè)月后對(duì)該豬場(chǎng)進(jìn)行回訪，情況已明顯改善。

據(jù)張洪亮等[18]報(bào)道，2016年前我國(guó)以HP-PRRSV流行為主，之后分離到NADC-30 like毒株的比例逐漸升高，甚至超過(guò)了HP-PRRSV的比例，成為我國(guó)主要流行毒株。在遺傳進(jìn)化分析基礎(chǔ)上，對(duì)于該豬場(chǎng)PRRS的控制并未緊急注射疫苗，原因在于目前市場(chǎng)上無(wú)有效的預(yù)防NADC30-like亞群的疫苗，若使用其他疫苗雖可產(chǎn)生部分交叉保護(hù)，但不同亞群之間容易發(fā)生重組，擴(kuò)大PRRSV的感染，風(fēng)險(xiǎn)較大。

PCV2在國(guó)內(nèi)外豬群中廣泛存在，長(zhǎng)期流行，并在疫苗的壓力下產(chǎn)生了多種不同基因型，給PCV2的防控帶來(lái)困難。目前，PCV-2b與PCV-2d是目前我國(guó)主要流行毒株[19]。PCV-1225毒株經(jīng)遺傳進(jìn)化分析確定屬于PCV-2b基因型，為豬場(chǎng)精準(zhǔn)防控提供指導(dǎo)。

近年來(lái)，中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)飛速發(fā)展，但混合感染、新變異毒株等情況引起的臨床癥狀與以往不同，及時(shí)準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并對(duì)陽(yáng)性毒株進(jìn)行基因型的確定，才能保障豬場(chǎng)疾病的有效精準(zhǔn)防控，使豬場(chǎng)損失降低到最低水平。