楊 陽， 聶豐秋，鄒盼盼，史立建，王朝霞，王春江，王 邁，曹省艷，齊雪峰*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.河北威遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，河北石家莊 052165；3.石家莊市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北石家莊 050026；4.綿陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川綿陽 621000)

隨著生活水平的提高，人們對(duì)畜產(chǎn)品的需求逐步從數(shù)量轉(zhuǎn)向數(shù)量與質(zhì)量并重。目前，歐盟已全面禁止抗生素在飼料中的添加使用，我國也對(duì)抗生素的使用做出了明確規(guī)定，抗生素作為飼料添加劑在2020年全部退出。在我國當(dāng)前養(yǎng)殖條件和模式下，這必定會(huì)對(duì)畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成一定程度的影響[1]。植物精油是指從植物全草、果實(shí)、葉、花、根、皮、樹皮和樹膠中提煉萃取出的具有強(qiáng)烈氣味和香味的揮發(fā)性液體[2]，其在養(yǎng)殖業(yè)中常被作為一種綠色、高效、安全的飼料添加劑[3]。從成分上講，植物精油是由多種化合物組成的混合物，精油單體分為萜烯和苯丙烯兩類，養(yǎng)殖業(yè)常用的精油單體有香芹酚、百里香酚、檸檬醛、丁香酚、肉桂醛等[4]，這些單體中如香芹酚和百里香酚對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌和酵母具有廣泛的抑菌活性[5]。在飼養(yǎng)中，常將不同精油單體按一定的比例配制成復(fù)合植物精油，以提高抑菌活性。研究表明，植物精油能維持腸道健康，緩解早期斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬的不良影響，降低腹瀉率，提高日增重[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞 分離自病豬腸道的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)，由綿陽師范學(xué)院動(dòng)物應(yīng)用研究所分離和鑒定。永生化豬小腸上皮細(xì)胞系ZYM-SIEC02(保藏號(hào)：CCTCC-C201001，專利號(hào)：ZL201010228957.3)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院張彥明教授惠贈(zèng)[7]。

1.1.2 主要試劑 香芹酚、肉桂醛、百里香酚單體及復(fù)合植物精油，河北威遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品； 6 mm×1 mm空白藥敏紙片，Thermo Oxoid公司產(chǎn)品；DMEM/F-12，Gibco公司產(chǎn)品；AG RNAex Pro RNA提取試劑，湖南艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；EnoGeneCellTMCounting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞活力檢測試劑盒，EnoGene公司產(chǎn)品；EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix，PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 721E型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；Leica EM UC7型超薄切片機(jī)，徠卡顯微系統(tǒng)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；JEOL JEM-1230型透射電鏡，日本電子株式會(huì)社(JEOL)產(chǎn)品；VELETA G3型側(cè)插式透射電鏡拍照裝置，德國EMSIS GmbH公司產(chǎn)品；CFX Connect型熒光定量基因擴(kuò)增儀，新加坡伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇和菌懸液制備 根據(jù)文獻(xiàn)[8]，將在-80 ℃保存的上述3種豬腸道致病菌菌株2次活化后，LB瓊脂平板表面連續(xù)劃線，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h。挑取單菌落接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。測定并調(diào)整菌懸液OD 600 nm=0.5，使菌液含菌量約為1×108CFU/mL。

1.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng) 將液氮中凍存的豬小腸上皮細(xì)胞于37 ℃水浴鍋中解凍、離心后，加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基， 于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀況傳代培養(yǎng)3次后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 無水乙醇抑菌圈法抑菌試驗(yàn) 復(fù)合植物精油不溶于水，以乙醇溶液作為溶劑，一定濃度的乙醇溶液具有抑菌作用，為排除乙醇對(duì)抑菌結(jié)果的影響，以無水乙醇和滅菌磷酸緩沖溶液配制300、400、500、600 mL/L的乙醇溶液以篩選最適溶劑濃度，將無菌空白藥敏片在乙醇溶液中浸泡1 h，貼于涂布50倍稀釋菌懸液的LB固體培養(yǎng)基表面，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 復(fù)合植物精油抑菌圈法抑菌試驗(yàn) 以上述試驗(yàn)中最適乙醇濃度為溶劑稀釋復(fù)合植物精油。將0.1 mL復(fù)合植物精油與9.9 mL乙醇溶液混合，所得精油濃度為10 μL/mL，將無菌空白藥敏片在精油溶液(10 μL/mL)中浸泡1 h，貼于涂布50倍稀釋菌懸液的LB固體培養(yǎng)基表面，37 ℃倒置培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 復(fù)合植物精油最小抑菌濃度(MIC)測定 在96孔板中加入100 μL含菌量為1×108CFU/mL的菌懸液，加入梯度稀釋的復(fù)合植物精油，37 ℃培養(yǎng)18 h，測定菌懸液600 nm波長的OD值。

1.2.6 透射電鏡觀察復(fù)合植物精油對(duì)菌體影響 將1×108CFU/mL的3種菌懸液3 mL，分別加入MIC和0.5倍MIC的復(fù)合植物精油，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，25 mL/L戊二醛避光固定過夜；加入10 mg/mL鋨酸固定70 min，脫水，滲透，超薄切片，透射電鏡觀察。

1.2.7 復(fù)合植物精油細(xì)胞毒性試驗(yàn) 在96孔板中加入100 μL(約1×104)細(xì)胞懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。加入梯度稀釋的復(fù)合植物精油，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h和48 h。加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下孵育4 h，測定450 nm波長的OD值。

1.2.8 豬小腸上皮細(xì)胞炎癥損傷模型構(gòu)建及炎癥因子mRNA表達(dá)水平的檢測 在12孔板中加入1 mL(約1×106)細(xì)胞懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞密度達(dá)到80%，每孔加入1 mL含20 mL/L胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，30 μL濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)2、4、6 h。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR檢測細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量。擴(kuò)增基因?yàn)椋害?actin、IL-1β、TNF-α、IL-6，采用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。

表1 細(xì)胞因子及內(nèi)參引物序列

1.2.9 復(fù)合植物精油對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞炎癥損傷模型細(xì)胞因子表達(dá)量影響 在12孔板中加入1 mL(約1×106)細(xì)胞懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%，加入1 mL含最適工作濃度復(fù)合植物精油的20 mL/L胎牛血清DMEM/F-12完全培養(yǎng)基，30 μL濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)2.0、4.0、6.0 h。提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，檢測細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 適宜溶劑濃度的篩選

不同濃度乙醇對(duì)3種致病菌的抑菌結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為600 mL/L時(shí)，其對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌有抑菌效果，對(duì)沙門氏菌無抑菌效果；當(dāng)乙醇濃度低于500 mL/L時(shí)，其對(duì)3種致病菌均無抑菌效果。由于乙醇在恒溫培養(yǎng)過程中存在揮發(fā)問題，選擇400 mL/L乙醇溶液作為精油的溶劑。

2.2 復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌的抑菌圈直徑

復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌的抑菌圈直徑見圖1，結(jié)果表明，復(fù)合植物精油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為(15.60±0.79)mm、(19.17±0.85)mm、(11.43±0.31)mm。根據(jù)文獻(xiàn)[9]對(duì)抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>15 mm為最敏感，10 mm～15 mm為中度敏感，7 mm～9 mm為低度敏感，無抑菌圈為不敏感。這表明大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)合植物精油最敏感；沙門氏菌對(duì)復(fù)合植物精油中度敏感。

圖1 復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌的抑菌圈直徑

2.3 復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌的最小抑菌濃度

根據(jù)文獻(xiàn)[10]對(duì)抑菌率的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)合植物精油抑菌率(%)=[(陽性對(duì)照孔OD-陰性對(duì)照孔OD)-(藥物孔OD-陰性對(duì)照孔)]/(陽性對(duì)照孔OD-陰性對(duì)照孔)×100%。將抑菌率與EUCAST各抗菌藥物藥敏折點(diǎn)的抑菌率比對(duì)，當(dāng)抑菌率大于90%，MIC可靠，當(dāng)抑菌率小于90%，MIC不可靠，需對(duì)MIC重新判定。將有明顯渾濁孔所對(duì)應(yīng)精油濃度的上一個(gè)精油稀釋濃度作為復(fù)合植物精油對(duì)該細(xì)菌的最小抑菌濃度。復(fù)合植物精油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌率如圖2所示，結(jié)果表明，復(fù)合植物精油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度均為0.42 μL/mL。

圖2 復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌的抑菌率

2.4 透射電鏡觀察復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌菌體結(jié)構(gòu)的損傷作用

復(fù)合植物精油對(duì)3種細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用如圖3所示，與對(duì)照組(圖3A～圖3C)相比，與1 MIC濃度復(fù)合植物精油共孵育6 h，細(xì)菌出現(xiàn)形狀不規(guī)則，細(xì)胞壁、膜界限模糊，質(zhì)壁分離，形成空腔，細(xì)胞質(zhì)淡染、空化；部分細(xì)菌細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，產(chǎn)生細(xì)胞空腔、空化和解體(圖3D～圖3F)。與0.5 MIC濃度復(fù)合植物精油作用6 h，細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞壁、膜間隙明顯增寬，也出現(xiàn)了細(xì)胞壁、膜界限模糊，細(xì)胞質(zhì)泄漏，細(xì)胞空化的現(xiàn)象，效果弱于1 MIC濃度復(fù)合植物精油作用組(圖3G～圖3I)。

A、B、C.空白對(duì)照組；D、E、F.1 MIC濃度復(fù)合植物精油處理6 h；C、F、I.0.5 MIC濃度復(fù)合植物精油處理6 h

2.5 復(fù)合植物精油細(xì)胞工作濃度的篩選

根據(jù)文獻(xiàn)[11]對(duì)存活率計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)菌的存活率(%)=(加藥細(xì)胞OD-本底OD)/(對(duì)照細(xì)胞OD-本底OD)×100%，不同濃度復(fù)合植物精油作用下豬小腸上皮細(xì)胞的存活率如圖4，將細(xì)胞存活率大于70%的最大精油濃度作為復(fù)合植物精油體外細(xì)胞試驗(yàn)中的工作濃度。結(jié)果表明，復(fù)合植物精油在細(xì)胞試驗(yàn)中的工作濃度為0.063 μL/mL。

圖4 復(fù)合植物精油對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖抑制曲線

2.6 3種致病菌感染豬小腸上皮細(xì)胞炎癥損傷模型的建立

3種致病菌與豬小腸上皮細(xì)胞共孵育2、4、6 h后，上皮細(xì)胞細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖5所示，共孵育2 h，僅有與金黃色葡萄球菌共孵育的上皮細(xì)胞IL-1β、TNF-α mRNA顯著上調(diào)(P<0.05)；共孵育4 h，與金黃色葡萄球菌共孵育的上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α和與沙門氏菌共孵育的上皮細(xì)胞IL-6 mRNA極顯著上調(diào)(P<0.01)；共孵育6 h，與3種致病菌共孵育的上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均極顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖5 3種致病菌感染的豬小腸上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.7 復(fù)合植物精油對(duì)致病菌感染豬小腸上皮細(xì)胞所引起炎癥反應(yīng)的抑制作用

復(fù)合植物精油與3種致病菌誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞炎癥損傷模型共孵育2、4、6 h后，炎癥模型細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量如圖6所示，與對(duì)照組相比，共孵育2 h后，大腸埃希氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥IL-6和TNF-α mRNA極顯著上調(diào)(P<0.01)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥IL-6 mRNA極顯著上調(diào)(P<0.01)，沙門氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥TNF-α mRNA極顯著上調(diào)(P<0.01)；共孵育4 h，大腸埃希氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥IL-1β和IL-6 mRNA極顯著下調(diào)(P<0.01)，TNF-α mRNA極顯著下調(diào)(P<0.01)，金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥TNF-α mRNA極顯著下調(diào)(P<0.01)，沙門氏菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥TNF-α mRNA顯著下調(diào)(P<0.05)，IL-1β和IL-6極顯著下調(diào)(P<0.01)，共孵育6 h，3種致病菌誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA均極顯著下調(diào)(P<0.01)。

A、B、C.復(fù)合植物精油與大腸埃希氏菌炎癥模型共孵育2、4、6 h；D、E、F.復(fù)合植物精油與金黃色葡萄球菌炎癥模型共孵育2、4、6 h；G、H、I.復(fù)合植物精油與沙門氏菌炎癥模型共孵育2、4、6 h

3 討論

大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌是引起仔豬腹瀉的常見病原。仔豬因腸道內(nèi)尚未建立穩(wěn)定的微生物系統(tǒng)，自身抵抗力較弱，對(duì)外界刺激敏感，易受到各種病原微生物的侵襲和各種應(yīng)激因素的影響[12]。紙片擴(kuò)散法顯示，復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌均有抑制效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌最敏感，大腸埃希氏菌次之，沙門氏菌最不敏感。有研究表明，植物精油主要作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而殺滅病原菌[13]。透射電鏡結(jié)果顯示，3種細(xì)菌與復(fù)合植物精油共孵育6 h，細(xì)菌細(xì)胞壁、膜結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)容物流失，細(xì)菌解體。

細(xì)菌細(xì)胞壁抗原引起腸道上皮細(xì)胞分泌合成多種細(xì)胞因子，激活機(jī)體腸道內(nèi)先天免疫防御機(jī)制[14]。利用致病菌誘發(fā)豬小腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)構(gòu)建炎癥損傷模型，RT-qPCR檢測表明，細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)mRNA水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，說明細(xì)菌含量在1×108CFU/mL作用6 h可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌大量炎癥因子，炎癥模型建立成功。

百里香酚可以下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的豬小腸上皮細(xì)胞IL-8和TNF-α的表達(dá)[15]，肉桂醛和百里香酚組成的復(fù)合精油能下調(diào)仔豬空腸TNF-α和IL-1的表達(dá)，從而抑制腸道炎癥[16]。以香芹酚和百里香酚為主要成分的牛至油可下調(diào)空腸NF-κB p65蛋白表達(dá)，從而降低空腸IL-1β、IL-6、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1和IFN-γ的表達(dá)[17]。利用RT-qPCR檢測由香芹酚、百里香酚和肉桂醛組成的復(fù)合植物精油對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞炎癥損傷模型細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，復(fù)合精油能夠極顯著降低豬小腸上皮細(xì)胞促炎細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)mRNA表達(dá)量(P<0.01)。以上研究表明，以香芹酚、百里香酚和肉桂醛配制的復(fù)合植物精油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有較好的抑菌活性，對(duì)3種致病菌最小抑菌濃度均為0.42 μL/mL；同時(shí)，復(fù)合植物精油對(duì)3種致病菌所引起的豬小腸上皮細(xì)胞炎癥有一定的抑制作用，為進(jìn)一步研究植物精油與上皮細(xì)胞作用機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。