張 偉，朱怡萱，彭 菲，劉詩芃，向微微，賽福丁·阿不拉，阿得力江·吾斯曼，劉丹丹*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.滿洲里海關(guān)技術(shù)中心，內(nèi)蒙古滿洲里 021400 )

奶牛乳腺炎是由于病原微生物黏附于乳腺組織而引發(fā)的一種泌乳期奶牛常見病，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)奶牛乳腺炎的病原微生物高達(dá)130多種，其中大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌占80%以上[1]。目前，臨床治療奶牛乳腺炎以抗菌藥物為主，但隨著抗菌藥物的長期使用甚至濫用，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、乳中藥物殘留等問題日漸凸顯。因此，尋找新型、安全、低殘留的抑菌抗炎獸用藥物意義重大。已有研究證實(shí)，天然藥材及其多種次生產(chǎn)物對(duì)致乳腺炎病原菌具有良好的抑制作用[2-3]，應(yīng)用植物中獲取的抑菌抗炎成分，來預(yù)防和控制奶牛乳腺炎的發(fā)生，具有低毒、環(huán)保、高效等優(yōu)點(diǎn)，因此該防治方式已逐漸被現(xiàn)代畜牧業(yè)所關(guān)注。

雪白睡蓮花是睡蓮科睡蓮屬雪白睡蓮(Nymphaeacandida)的干燥花蕾，主要分布于我國新疆南部地區(qū)[4]?！吨腥A本草維吾爾藥卷》中記載，雪白睡蓮花具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神、益心護(hù)腦等功效，臨床上常用于治療咽痛、慢驚風(fēng)、熱癥所致的頭疼、咳嗽等病癥，有一定的抗氧化、保肝、抗菌、降血糖和神經(jīng)保護(hù)等作用[5]。多項(xiàng)研究報(bào)道[6-8]，不同提取方法提取出的睡蓮活性成分對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌均具有良好的抑菌效果。本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)雪白睡蓮花水提物和醇提物均對(duì)奶牛乳房炎致病菌和其所引發(fā)的炎癥有一定抑菌抗炎作用，基于此，為評(píng)價(jià)其多糖、黃酮的抑菌抗炎效果，本研究擬定采用牛津杯法結(jié)合倍比稀釋法測定抑菌圈、最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)，探討雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌(大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌)的抑制效果；同時(shí)，建立小鼠耳廓腫脹模型，考察雪白睡蓮花多糖、黃酮的抗炎作用，以期為雪白睡蓮花的開發(fā)利用及作為防治奶牛乳腺炎潛力藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 雪白睡蓮花，購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院； SPF級(jí)雄性昆明小鼠(18 g～22 g)，由新疆醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；奶牛乳腺炎主要致病菌大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)E3、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)9-14、鏈球菌(Streptococcusagalactiae)151105，由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 主要試劑 地塞米松片，浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；MH(A)培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；二甲苯等其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 小型粉碎機(jī)(ZN-08)，北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；電子天平(ME-204E)，梅特勒- 托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；三用恒溫水箱(12H-W420)，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品；低速離心機(jī)(TDL-40B)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；磁力攪拌器(MS-H280-pro)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52)，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；空氣震蕩培養(yǎng)箱(ST-F160AC)，北京桑翌實(shí)驗(yàn)儀器研究所產(chǎn)品；酶標(biāo)分析儀(HTX)，美國伯騰儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器(WD-9415E)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 將于500 mL/L甘油-20 ℃保存的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌分別接種于液體肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，劃線接種于瓊脂固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)至相應(yīng)細(xì)菌生長期，挑取典型單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 睡蓮花活性成分提取與鑒定

1.2.2.1 雪白睡蓮花多糖的提取與鑒定 雪白睡蓮花多糖的提?。撼善犯稍镅┌姿徎ù蚍郏?0目過篩后稱取50 g，加蒸餾水700 mL，210 W超聲功率提取30 min，重復(fù)提取2次，合并2次濾液，減壓濃縮，加無水乙醇至其濃度為800 mg/mL，4 ℃靜置醇析，離心取沉淀物，烘干得到雪白睡蓮花多糖。

雪白睡蓮花多糖的鑒定：采用Molish法[9]，以乳糖溶液為陽性對(duì)照，蒸餾水為空白對(duì)照，量取1 mL待測溶液加入0.5 mL 50 mg/mL苯酚，混勻后緩慢加入2.5 mL濃硫酸，液面間有紺青色環(huán)判定為多糖陽性。

1.2.2.2 雪白睡蓮花黃酮的提取與鑒定 雪白睡蓮花黃酮的提?。撼善犯稍镅┌姿徎ù蚍郏?0目過篩后稱取50 g，加入800 mL/L 乙醇1 500 mL，180 W超聲功率提取20 min，抽濾除雜，減壓濃縮，烘干得黃酮。

雪白睡蓮花黃酮的鑒定：采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)法[10]，以蘆丁溶液作陽性對(duì)照，蒸餾水作空白對(duì)照，量取1 mL黃酮溶液，加入鎂粉，再緩慢滴加濃鹽酸，片刻后觀察，液體變?yōu)槌燃t色至紫色判斷為黃酮陽性。

1.2.3 雪白睡蓮花多糖提取率測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 首先精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，從中吸取10 mL再次定容至100 mL，得0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至試管，加蒸餾水補(bǔ)足2 mL，然后分別加入1 mL苯酚溶液，5 mL濃硫酸震蕩搖勻，冷卻后置于30 ℃水浴鍋中，水浴20 min后用紫外分光光度計(jì)于波長490 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 雪白睡蓮花多糖得率的測定 精密稱取50 mg所得的多糖，置于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，從中吸取10 mL定容至100 mL，作為待測樣品液。精密量取待測樣品液1 mL至試管，加蒸餾水補(bǔ)足2 mL后，按照1.2.3.1方法測定其吸光度值，依回歸方程計(jì)算多糖提取率。

1.2.4 雪白睡蓮花黃酮提取率的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用800 mL/L乙醇定容。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL至試管中，加入50 mg/mL亞硝酸鈉0.3 mL，混勻靜置6 min后，加入100 mg/mL硝酸鋁0.3 mL，混勻靜置6 min后，再加入40 mg/mL氫氧化鈉溶液4 mL，加水定容至10 mL靜置15 min，用紫外分光光度計(jì)于波長510 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 雪白睡蓮花黃酮提取率的測定 稱取10 mg所得的雪白睡蓮花黃酮置于25 mL容量瓶中，用800 mL/L乙醇定容，作為待測樣品液。量取待測樣品液1 mL至試管中，按照1.2.4.1方法測定其吸光度值，依回歸方程計(jì)算黃酮提取率。

1.2.5 雪白睡蓮花活性成分體外抑菌試驗(yàn)

1.2.5.1 雪白睡蓮花活性成分抑菌效果測定 采用牛津杯法[2]，將高壓滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基每個(gè)培養(yǎng)皿中分裝20 mL，使其均勻攤布，放置在超凈臺(tái)內(nèi)等待凝固，取4 ℃保存菌液以麥?zhǔn)媳葷峁転閰⒖迹♂屩辆汉繛?.5×106CFU/mL。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入100 μL稀釋好的菌液，用涂布棒涂布均勻，將4個(gè)牛津杯等距放置于鋪滿菌液的的培養(yǎng)基上，每杯中分別加入100 μL多糖、黃酮、生理鹽水、慶大霉素，每種菌株及其試驗(yàn)藥物重復(fù)3次，以生理鹽水作為空白對(duì)照組，慶大霉素作為陽性對(duì)照組。37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：R≥15 mm為高敏，10 mm≤R<15 mm為中敏，8 mm≤R<10 mm為低敏，R<8 mm為不敏感，-表示無抑菌圈。

1.2.5.2 最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)的測定 采用倍比稀釋法對(duì)藥物進(jìn)行MIC的測定[11]。在無菌96孔板各孔內(nèi)加入滅菌肉湯100 μL，第1孔中加入滅菌受試藥液100 μL(藥液質(zhì)量濃度為0.1 g/mL)，吹打混勻，從中吸取混勻液加入下一孔，如此二倍稀釋至第9孔后棄去100 μL。第10孔不加藥，第11孔中只加受試藥物，第12孔二者均不加，作為空白對(duì)照組。前10孔中分別加入10 μL菌液混勻，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

選用MIC試驗(yàn)中未見渾濁的孔，每孔各取50 μL液體，加入瓊脂肉湯固體培養(yǎng)基，用滅菌涂布棒均勻涂布于培養(yǎng)基中，每孔做3個(gè)平行重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h～24 h。以平板上生長的菌落數(shù)小于5個(gè)作為受試藥物的MBC[12]。

1.2.6 雪白睡蓮花活性成分體外抗炎試驗(yàn) 取雄性昆明小鼠16只，體質(zhì)量18 g～22 g，隨機(jī)分為4組：雪白睡蓮花多糖、黃酮組，按1.37 g/kg灌胃；陽性對(duì)照組選取地塞米松，按0.02 g/kg灌胃；空白對(duì)照組選取生理鹽水，按10 mL/kg灌胃。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d，第7天給藥后0.5 h，將0.02 mL二甲苯均勻涂抹于小鼠左耳致炎，右耳不做處理，1 h后處死小鼠剪下雙耳，用8 mm打孔器取耳片，電子天平稱重。觀察雪白睡蓮花活性成分對(duì)二甲苯引起的耳廓腫脹度、腫脹率及腫脹抑制率的影響。計(jì)算方法如下[11]：

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量

腫脹率=[(右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量)/左耳片質(zhì)量]×100%

腫脹抑制率=[(空白對(duì)照組耳腫脹度-用藥組耳腫脹度)/空白對(duì)照組耳腫脹度]×100%

2 結(jié)果

2.1 雪白睡蓮花多糖的理化鑒別及提取率測定結(jié)果

經(jīng)Molish反應(yīng)鑒定，提取物中含有多糖。以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。經(jīng)計(jì)算得到的回歸方程為：y= 8.271 4x+ 0.059 4，相關(guān)系數(shù)r2=0.997 6，根據(jù)此回歸方程計(jì)算出本樣品多糖提取率為51.78%。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 雪白睡蓮花黃酮的理化鑒別及提取率結(jié)果

經(jīng)鹽酸-鎂粉反應(yīng)鑒定，提取物中含有黃酮。以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。經(jīng)計(jì)算得到的回歸方程為：y= 11.47 5x+ 0.020 6，相關(guān)系數(shù)r=0.998 8，根據(jù)此回歸方程計(jì)算出本樣品黃酮提取率為12.00%。

圖2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 雪白睡蓮花活性成分體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 抑菌圈的測定結(jié)果 由表1可知，金黃色葡萄球菌對(duì)雪白睡蓮花多糖高敏，抑菌圈直徑為23.01 mm±0.43 mm；金黃色葡萄球菌、鏈球菌對(duì)雪白睡蓮花黃酮高敏，抑菌圈直徑分別為24.07 mm±0.72 mm、16.80 mm±0.37 mm，大腸埃希氏菌對(duì)雪白睡蓮花黃酮中敏，抑菌圈直徑為13.30 mm±0.27 mm。

表1 雪白睡蓮花多糖、黃酮的體外抑菌結(jié)果

2.3.2 MIC和MBC的測定結(jié)果 雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)3種致病菌的MIC和MBC測定結(jié)果見表2。雪白睡蓮花多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為3.125 mg/mL，MBC為6.25 mg/mL，表明雪白睡蓮花多糖對(duì)金黃色葡萄球菌有良好的抑制作用；雪白睡蓮花黃酮對(duì)3種致病菌(大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌)的MIC分別為6.25、3.125、0.39 mg/mL，MBC分別為12.5、6.25、0.78 mg/mL，提示雪白睡蓮花黃酮對(duì)3種致病菌均有抑制作用。

表2 雪白睡蓮花多糖、黃酮的MIC和MBC結(jié)果

2.4 雪白睡蓮花活性成分體外抗炎試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，雪白睡蓮花多糖組、黃酮組能明顯降低二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹，且差異極顯著(P<0.01)，腫脹抑制率分別為83.11%、65.15%；與陽性對(duì)照組對(duì)比，雪白睡蓮花多糖組腫脹抑制率變化差異不顯著；表明雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)急性炎癥腫脹有一定的抑制作用。

表3 雪白睡蓮花活性成分耳廓腫脹試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

研究表明，多糖、黃酮是天然藥物的重要活性成分，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、藥用價(jià)值高，不同植物的多糖、黃酮都普遍具有明顯的抑菌、抗炎、降血脂、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡及提高免疫功能等作用[12-17]，而黃酮、多糖及多酚類化合物是雪白睡蓮花的主要活性成分?；诖?，本研究對(duì)雪白睡蓮花采用超聲波提取法提取活性成分(多糖、黃酮)、對(duì)其活性成分進(jìn)行理化鑒別及提取率測定。超聲波提取法是利用超聲波的空化效應(yīng)，破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，加快細(xì)胞內(nèi)活性成分的釋放和溶解，從而提高提取率，因其操作簡便、提取率高、產(chǎn)品純度高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于中藥活性成分的提取[20-22]。結(jié)果顯示采用超聲波提取法可成功提取目標(biāo)物質(zhì)，多糖、黃酮提取率分別為51.78%、12.00%。同時(shí)，本研究采用牛津杯法、倍比稀釋法結(jié)合二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)，考察雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌的體外抑菌與抗炎效果。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌對(duì)雪白睡蓮花多糖高度敏感，抑菌圈直徑達(dá)23.01 mm±0.43 mm；金黃色葡萄球菌和鏈球菌對(duì)雪白睡蓮花黃酮高度敏感，抑菌圈直徑分別為24.07 mm±0.72 mm、16.80 mm±0.37 mm，大腸埃希氏菌對(duì)雪白睡蓮黃酮中度敏感，抑菌圈直徑為13.30 mm±0.27 mm。雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)3種致病菌均具有一定的抑菌作用，對(duì)供試菌的抑菌效果為金黃色葡萄球菌>鏈球菌>大腸埃希氏菌。抗炎試驗(yàn)結(jié)果顯示，雪白睡蓮花多糖、黃酮對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹均有一定的抑制效果，且多糖效果優(yōu)于黃酮效果，表明二者對(duì)急性炎癥有一定的抑制作用。

綜上所述，雪白睡蓮花黃酮、多糖成分對(duì)奶牛乳腺炎主要致病菌具有一定的的抑菌效果，能發(fā)揮抗炎作用，臨床上對(duì)于雪白睡蓮花黃酮和多酚的研究較多，研究方向偏向于肝纖維化保護(hù)作用[23-27]，多糖成分往往被忽略。本研究結(jié)果顯示，超聲波作用下，多糖成分提取率可觀，且對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑菌效果極佳，抑制小鼠耳腫脹的效果極佳，表明雪白睡蓮多糖在其活性成分中，占據(jù)一定的重要地位。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)其多糖成分的作用機(jī)理展開研究，以期為雪白睡蓮花的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。