劉雪松，張 艷，薛沾枚，蘇 景，郝敬友，唐 偉，劉彥凱，孫洪杰，徐 麗，史同瑞*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2. 黑龍江省獸用藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161005；3.黑龍江省動物疫病控制中心，黑龍江哈爾濱 150030；4.哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150030)

清肺顆粒是由板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗以及甘草組成的經(jīng)典復(fù)方中獸藥，被收錄在《中華人民共和國獸藥典》，具有清肺平喘、化痰止咳的功效[1]。清肺顆粒中富含多種中藥有效成分，包括表告乙春、槲皮素-3-o-β-D-葡萄糖-7-o-β-D-龍膽雙糖苷以及甘草苷等。微生物發(fā)酵是一種傳統(tǒng)的中藥炮制方法，具有提高中藥有效成分、產(chǎn)生新的活性成分、降低毒副作用、增強(qiáng)中藥藥效等優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)行發(fā)酵的微生物種類繁多，這些微生物可以產(chǎn)生分解植物細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)成分的酶，如纖維素酶、半纖維素酶以及淀粉酶等，使植物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變疏松，細(xì)胞間隙變大，釋放更多的中藥有效成分[2-3]。試驗(yàn)采用產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌，應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)，優(yōu)化了清肺顆粒組方的提取工藝以及制粒處方。對免疫抑制小鼠進(jìn)行灌胃給藥，通過檢測體重變化、脾臟、胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力、脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)以及血清因子含量等，探究清肺顆粒對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，為清肺顆粒的藥理學(xué)研究提供相應(yīng)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 清肺顆粒由板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗以及甘草組成。發(fā)酵清肺顆粒是利用黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院微生物研究所分離得到的解淀粉芽孢桿菌，以2%的接菌劑量和30%中藥粉、10%黃豆粉、0.2%CaCO3、59.8%水的比例進(jìn)行發(fā)酵提取后制粒獲得，發(fā)酵清肺顆粒由哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司制備并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 Balb/c小鼠60只，8周齡，雌雄各半，購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.3 主要試劑 環(huán)磷酰胺，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RPMI-1640培養(yǎng)基，上海語純生物科技有限公司產(chǎn)品；刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)和CCK-8，美國Sigma公司產(chǎn)品；IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 分析天平(WT1003H)，常州萬泰天平儀器有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機(jī)(TG16B)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000Ⅱ)、超凈工作臺(CJ-2S)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(Elx808)，美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱(HF90)，上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組 在試驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境1周。適應(yīng)后，將小鼠隨機(jī)分組，分別為正常組、模型組以及發(fā)酵清肺顆粒組(25、50、100 mg/kg)。根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，對模型組以及發(fā)酵清肺顆粒組進(jìn)行環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠的建立[4-5]。第1天～第3天，腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，劑量為70 mg/kg。第5天，改為劑量為90 mg/kg。小鼠達(dá)到免疫抑制狀態(tài)后，發(fā)酵清肺顆粒組連續(xù)灌胃給藥7 d，每天1次。正常組和模型組灌胃無菌生理鹽水。

1.2.2 體重檢測 從灌胃發(fā)酵清肺顆粒開始，每天檢測各組的小鼠體重，共檢測5 d。

1.2.3 脾臟、胸腺指數(shù)測定 最后1次灌胃給藥后，無菌取出小鼠完整的胸腺以及脾臟。用生理鹽水洗盡血污后，用濾紙吸干水分。對胸腺以及脾臟稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)。計(jì)算公式如下：

臟器重量(mg)/體重(g)=臟器指數(shù)

1.2.4 巨噬細(xì)胞吞噬能力 根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定[6]。最后1次灌胃給藥后，小鼠進(jìn)行處死，用750 mL/L酒精浸泡消毒，在無菌條件下腹腔注射5 mL PBS，收集腹腔注射液，重復(fù)注射以及收集3次，合并收集液，1 500 r/min離心15 min，棄去上清液，加入Tris-NH4Cl 1 mL，室溫下靜置10 min，1 500 r/min 離心10 min，留沉淀細(xì)胞。重復(fù)此操作直至紅細(xì)胞全部裂解。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整巨噬細(xì)胞密度達(dá)到2×106個/mL，活細(xì)胞數(shù)大于95%。在96孔板中，每孔加入100 μL巨噬細(xì)胞，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)6 h，在每孔中加入100 μL 1 mg/mL的中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄去上清液，每孔用PBS重復(fù)沖洗3次，加入細(xì)胞裂解液100 μL，輕微搖晃，4 ℃條件下過夜。酶標(biāo)儀測定492 nm處OD值，以O(shè)D值表示巨噬細(xì)胞吞噬能力。

1.2.5 脾淋巴細(xì)胞增殖測定 參考相應(yīng)文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞懸液的制備及脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)[7-8]。最后1次灌胃給藥后，小鼠處死，無菌取出脾臟。無菌條件下，將脾臟研磨碎后放置于RPMI-1640不完全培養(yǎng)基中。過200目篩網(wǎng)，除去脂肪等雜質(zhì)，得到勻漿液。3 000 r/min離心10 min，獲得細(xì)胞沉淀，加入適量紅細(xì)胞裂解液反應(yīng)10 min，3 000 r/min離心10 min除去紅細(xì)胞。得到的細(xì)胞沉淀用RPMI-1640不完全培養(yǎng)基洗滌數(shù)次。最后加入適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%。48孔板中，試驗(yàn)孔加入50 μL脾細(xì)胞懸液，試驗(yàn)孔中再加入50 μL刀豆蛋白A或者脂多糖溶液溶液，使終濃度達(dá)到5 μg/mL。設(shè)置只含有脾細(xì)胞懸液的對照孔。以上試驗(yàn)結(jié)重復(fù)3次。將加完樣的48孔板放置在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，充分混勻后，在450 nm波長測定吸光度(OD)值。刺激指數(shù)為指標(biāo)，評定小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖程度，計(jì)算公式如下：

1.2.6 細(xì)胞因子含量測定 最后1次灌胃給藥后，進(jìn)行眼眶靜脈叢采血。采血后，3 500 r/min條件下離心15 min，獲得血清。采用ELISA試劑盒檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4以及IL-10細(xì)胞因子含量。

1.2.7 Th1/Th2比值計(jì)算 IFN-γ和IL-4分別體現(xiàn)了Th1型和Th2型淋巴細(xì)胞的主要效應(yīng)，這2種細(xì)胞因子經(jīng)常作為監(jiān)測Th1型和Th2型淋巴細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)。在測定完細(xì)胞因子含量后，根據(jù)IFN-γ與IL-4因子含量計(jì)算Th1/Th2比值。公式如下:

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵清肺顆粒對小鼠體重的影響

小鼠體重變化如表1所示。從表1可以看出，注射環(huán)磷酰胺對小鼠體重的影響較大，與正常組相比，模型組小鼠顯著下降，下降了28%左右。給藥組在不同程度上可以使注射環(huán)磷酰胺的減重效果減輕。相比較于模型組，不同劑量的給藥組均顯著提升了小鼠的體重。

表1 小鼠體重變化情況

2.2 脾臟、胸腺指數(shù)

脾臟指數(shù)以及胸腺指數(shù)分別如表2所示。從表2中可以看出，進(jìn)行環(huán)磷酰胺腹腔注射的模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯低于正常組。相比較于模型組來說，各個劑量的發(fā)酵清肺顆粒在一定程度上會增加小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。高劑量組的給藥可以顯著提升小鼠的指數(shù)，使指數(shù)接近到正常組的水平。

表2 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)

2.3 巨噬細(xì)胞吞噬能力

中性紅法測定巨噬細(xì)胞吞噬能力見表3。結(jié)果顯示，與正常組對比，經(jīng)過腹腔注射環(huán)磷酰胺后的小鼠巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力顯著下降。各劑量發(fā)酵清肺顆粒的小鼠巨噬細(xì)胞對比模型組，其對中性紅的吞噬能力都有所提升。其中高劑量發(fā)酵清肺顆粒組的吞噬能力較接近正常組水平。

表3 巨噬細(xì)胞吞噬能力

2.4 脾淋巴細(xì)胞增殖測定

脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果如表4。接受環(huán)磷酰胺腹腔注射的小鼠脾淋巴細(xì)胞對于刀豆蛋白A以及脂多糖誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)受到了明顯的抑制。低劑量發(fā)酵清肺顆粒組，沒有顯著提升刀豆蛋白A以及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力。中劑量組和高劑量組皆能夠顯著提升小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力。

表4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力

2.5 血清因子測定

血清中細(xì)胞因子含量測定結(jié)果如表5。與正常組相比較，IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6的含量在模型組小鼠中均明顯下降，而IL-4和IL-10明顯上升。與模型組相比較，對于IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6來說，給藥組均能顯著提升免疫小鼠血清中各細(xì)胞因子的含量。對于IL-4以及IL-10來說，給藥組均能有效減少其細(xì)胞因子含量。

表5 血清樣品中各因子的含量變化

2.6 Th1/Th2結(jié)果

Th1/Th2的值如表6所示。可以看出,模型組中Th1/Th2的比值明顯下降，各個劑量的給藥組相比較于模型組均有顯著提升，提升效果與劑量大小呈正相關(guān)。

表6 Th1/Th2的比值

3 討論

目前常用來建立免疫抑制小鼠模型的藥物很多，包括環(huán)磷酰胺、地塞米松、放線菌素以及環(huán)孢菌素A等，其中最常使用環(huán)磷酰胺進(jìn)行模型的建立。環(huán)磷酰胺是治療惡性腫瘤的經(jīng)典藥物之一，具有廣譜的抗癌作用，但與此同時也具有免疫抑制作用[9]。環(huán)磷酰胺可以用于乳腺癌、卵巢癌以及宮頸癌等癌癥的治療，也可作為免疫抑制劑用于自身免疫性疾病，包括全身性紅斑狼瘡、特發(fā)性血小板減少性紫癜以及多發(fā)性肉芽腫等的治療，又可以用于減少器官移植時的免疫排斥反應(yīng)[10-11]。李燕華等[12]的研究表明，單次大劑量和多次小劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液均可以成功建立免疫抑制模型。本次試驗(yàn)采用多次小劑量注射后，隔1 d以大劑量進(jìn)行環(huán)磷酰胺腹腔注射來建立小鼠免疫抑制模型。通過胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬能力以及細(xì)胞因子含量，可以看出模型組相比較于正常組，模型組小鼠的免疫受到了顯著抑制，達(dá)到了建立模型的目的。

脾臟和胸腺是非特異性免疫中的重要免疫器官，淋巴細(xì)胞在此分化、成熟并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官。免疫器官的發(fā)育狀況直接影響免疫功能和抵抗疾病的能力。以往研究表明，對小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺，可使脾臟淋巴細(xì)胞總數(shù)急劇下降，從而導(dǎo)致小鼠的脾臟和胸腺重量顯著下降[13]。在本次試驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺介導(dǎo)的免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)皆顯著低于正常組。低、中、高給藥組在不同程度上緩解了免疫抑制小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)下降的趨勢，顯著提升了胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。發(fā)酵清肺顆粒提高了脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)量，可能是造成脾臟和胸腺指數(shù)顯著上升的原因之一[14]。巨噬細(xì)胞的吞噬作用以及脾淋巴細(xì)胞的增殖，在宿主抵抗微生物入侵和外部刺激的先天防御中起著至關(guān)重要的作用[15-16]。吞噬細(xì)胞是先天免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對其吞噬能力的測定是評價(jià)細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)。對巨噬細(xì)胞吞噬作用的研究多采用中性紅試驗(yàn)。對于脾臟淋巴細(xì)胞的增殖作用，多采用刀豆蛋白A以及脂多糖刺激試驗(yàn)，其中T淋巴細(xì)胞免疫通過刀豆蛋白刺激的細(xì)胞增殖檢測，而B淋巴細(xì)胞免疫通過脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖檢測[17]。本次試驗(yàn)中，無論是以刀豆蛋白A進(jìn)行的T細(xì)胞刺激指數(shù)的測定，還是以脂多糖進(jìn)行的B細(xì)胞刺激指數(shù)的測定，與正常組相比，模型組菌顯著降低。而給藥組在不同程度上提升了脾淋巴細(xì)胞的增殖，顯著提升了免疫抑制小鼠的免疫能力。

根據(jù)T淋巴細(xì)胞表面CD分子的不同，可以將其分為CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞兩種細(xì)胞群。又根據(jù)其分泌細(xì)胞因子功能的不同，可以將CD4+T淋巴細(xì)胞分為Th1和Th2兩種類型。Th1細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子，其中包括IFN、TNF以及IL-2等，Th2細(xì)胞產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子，包括了IL-4、IL-6以及IL-10等[18]。在正常情況下，機(jī)體中Th1/Th2細(xì)胞的比值會處于相對平衡的狀態(tài)，如果機(jī)體發(fā)生了生理功能異常，這種平衡就會被打破，平衡將向一方偏移，這種現(xiàn)象被稱為“Th1/Th2平衡漂移”，“Th1/Th2平衡漂移”現(xiàn)象的出現(xiàn)已經(jīng)證實(shí)與疾病的發(fā)生密切相關(guān)[19]。本次試驗(yàn)中正常組小鼠的Th1/Th2比值與王永杰[8]報(bào)道的數(shù)值相似。模型組相比較于正常組，Th1/Th2比值顯著降低。而給藥組在不同程度上提升了Th1/Th2比值，將機(jī)體的細(xì)胞因子分泌情況向著正常方向發(fā)展。

發(fā)酵是中藥經(jīng)常使用的炮制方法之一，具有悠久的歷史。近些年來，發(fā)酵中藥對動物免疫調(diào)節(jié)作用的研究正在逐漸增多。顧艷麗等[20]對復(fù)方中藥發(fā)酵液對肉雞的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究，顯示復(fù)方中藥發(fā)酵液可以顯著提升肉雞的法氏囊指數(shù)。陳柯源等[21]進(jìn)行了當(dāng)歸補(bǔ)血湯發(fā)酵產(chǎn)物對肉雞免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)能提升肉雞的法氏囊指數(shù)，并且顯著提高IFN-γ、TNF-α、IL-2以及IL-6含量。通過本次試驗(yàn)可以看出，發(fā)酵清肺顆?？梢燥@著提升免疫抑制小鼠的免疫功能，使其免疫功能朝著正常的方向發(fā)展。