王申鋒，錢(qián)明珠,2，程 征，化 軍，朱紅標(biāo)，謝軍強(qiáng)，王德剛

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院，河南鄭州 451450; 2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130012;3.河南健恒動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河南鄭州 451476；4.鄭州航空港經(jīng)濟(jì)綜合試驗(yàn)區(qū)社會(huì)事業(yè)局，河南鄭州 450019；5.湯陰縣畜牧獸醫(yī)總站，河南湯陰 456150)

近年來(lái)，隨著奶牛養(yǎng)殖數(shù)量的增加，乳房炎發(fā)生與流行呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，且成為危害奶牛嚴(yán)重的疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)統(tǒng)計(jì)，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)中該病的發(fā)生率在20%以上，其他散養(yǎng)奶牛場(chǎng)該病發(fā)病率在50%以上，該病成為奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中常見(jiàn)疾病，給奶牛養(yǎng)殖帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。因此，應(yīng)該注意奶牛乳房炎的綜合防控。臨床中多種病原菌均可以引起奶牛乳房炎，以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)最為常見(jiàn)，該菌成為引起牛乳房炎主要病原菌之一[3]。金黃色葡萄球菌可以引起多種動(dòng)物和人發(fā)病，是臨床中常見(jiàn)的人獸共患病原菌之一，分布廣泛(如空氣、土壤、食品等)，感染金黃色葡萄球菌后，臨床中以敗血癥、化膿性感染、乳房炎、子宮內(nèi)膜炎等為常見(jiàn)[4-5]。金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致食物中毒重要的食源性病原菌，該菌主要存在于乳制品中，生鮮牛奶成為該菌主要的潛在載體[6-7]。因此，對(duì)生鮮牛奶的檢測(cè)具有重要的意義。臨床中金黃色葡萄球菌防治主要以抗菌藥物為主，隨著抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥菌株逐漸增多，對(duì)牛奶品質(zhì)和人們的健康存在潛在的威脅[8]。許多研究表明，金黃色葡萄球菌耐藥性的產(chǎn)生與其攜帶耐藥基因有關(guān)，耐藥基因的變異與表達(dá)，可以增加其耐藥性。本試驗(yàn)對(duì)2019年-2020年采集自河南鄭州地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶中疑似患有乳房炎的鮮奶樣品，進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定，對(duì)得到的分離株檢測(cè)其致病性、耐藥表型及耐藥基因，為該病的綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 2019年-2020年采集自鄭州地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)及散養(yǎng)戶中疑似患有乳房炎的鮮奶樣品，進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑 70 mL/L綿羊血脫纖培養(yǎng)基，購(gòu)自上海卒瑞生物科技有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基(甘露醇氯化鈉瓊脂鑒別培養(yǎng)基)，青島日水微生物科技有限公司產(chǎn)品；陽(yáng)性菌鑒定試紙條，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；藥敏紙片，常德比曼生物科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqMarker Mix，北京酷來(lái)搏科技有限公司產(chǎn)品； DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，北京邁瑞達(dá)科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 半自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)(K-3401型)，法國(guó)生物梅里埃股份有限公司產(chǎn)品；多功能梯度PCR儀(TC9600-G型)、凝膠成像儀(GelDocTMXR+型)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；雙人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FB型)、細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱(px-70型)，蘇州凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25 g左右的健康昆明系小鼠465只，由河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院牧業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 材料

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件下，對(duì)采集的鮮奶樣品進(jìn)行分裝和處理，處理的鮮奶樣品接種于70 mL/L綿羊血脫纖培養(yǎng)基37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h～24 h，挑取單個(gè)菌落接種于金黃色葡萄球菌鑒別培養(yǎng)基上(甘露醇氯化鈉鑒別培養(yǎng)基)上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，接種在普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中純化培養(yǎng)，并染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 對(duì)甘露醇氯化鈉鑒別培養(yǎng)基分離菌株，參照陽(yáng)性菌鑒定試紙條說(shuō)明書(shū)對(duì)分離菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)鑒定。

1.2.3 細(xì)菌的PCR鑒定 采用水煮法提取初步鑒定為金黃色葡萄球菌分離菌株的基因組DNA，參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道金黃色葡萄球菌特異鑒定引物femB基因，引物由華大基因公司合成，以提取的金黃色葡萄球菌分離菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定， PCR鑒定的陽(yáng)性菌株的產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果根據(jù)GenBank登錄的參考株進(jìn)行同源性對(duì)比。

1.2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 采用人工感染小鼠的方法進(jìn)行分離菌的致病性試驗(yàn)，將分離的92株金黃色葡萄球菌分離菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期計(jì)數(shù)為108CFU/mL，每株分離菌通過(guò)腹腔注射方式攻毒5只小鼠，劑量為0.25 mL，未攻毒組腹腔注射等量的無(wú)菌的PBS，每株分離菌株攻毒12 h后，隔離飼養(yǎng)觀察6 d，記錄發(fā)病及其死亡情況。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 參照標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法對(duì)分離的致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判斷，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),分析其致病性金黃色葡萄球菌的耐藥性。

1.2.6 細(xì)菌耐藥基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[9-10]，設(shè)計(jì)15種耐藥基因引物(表1)，其中四環(huán)素耐藥基因4種(tetK、tetL、tetM、tetO)，β-內(nèi)酰胺類(lèi)1種(blaZ)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因6種(ermA、ermB、ermC、linA、msrA、mphC、aac6-aph2)，多重耐藥基因(cfr、fexA、fexB)用梯度PCR對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表1 引物序列

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

疑似金黃色葡萄球菌的菌株在70 mL/L脫纖綿羊血培養(yǎng)基菌落呈現(xiàn)β溶血；在甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出淺黃色菌落；染色鏡檢可見(jiàn)單個(gè)短鏈、成堆串狀排列的革蘭氏陽(yáng)性球菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌的分離鑒定結(jié)果進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果顯示，92株分離菌株生化試驗(yàn)初步鑒定為金黃色葡萄球菌分離株。與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中生化特性基本上一致。

2.3 細(xì)菌的PCR鑒定結(jié)果

初步鑒定為金黃色葡萄球菌92株分離株用特異鑒定引物femB進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，由圖1可知，92株分離菌株均擴(kuò)增出大約為651 bp大小的目的基因femB片段，測(cè)序結(jié)果與GenBank中金黃色葡萄球菌參考株同源性比對(duì)同源性均大于98.9%，從分子水平上鑒定為金黃色葡萄球菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～6.臨床分離菌株; 7.空白對(duì)照

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后小鼠在攻毒試驗(yàn)期間表現(xiàn)出精神沉郁、采食量減少及急性死亡等不同的臨床癥狀，從死亡的試驗(yàn)小鼠體內(nèi)分離到攻毒菌株(金黃色葡萄球菌)，直到攻毒試驗(yàn)結(jié)束，未攻毒的小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀。不同的分離菌株對(duì)試驗(yàn)小鼠具有不同的致病性，其中致小鼠死亡4/5只、5/5只菌株最多，分別占分離菌株的34.7%、44.4%。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離的75株致病性金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離的75株沙門(mén)菌耐藥性嚴(yán)重，對(duì)鏈霉素、阿莫西林、氨芐西林、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、阿米卡星、磺胺間甲氧嘧啶、紅霉素9種藥物耐藥率較高，耐藥率在77.3%～98.7%之間；對(duì)多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氨曲南、大觀霉素、多黏菌素5種藥物的耐藥率在45.3%～64.0%之間；對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、恩諾沙星、林可霉素耐藥率在13.3%～22.7%之間(表2)。

表2 75株致病性金黃色葡萄球菌耐藥性分析結(jié)果

2.6 多重耐藥性分析結(jié)果

由表3可知，臨床中分離的75株金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)多重耐藥性，耐17種藥物有1株、耐16、7種藥物各3株，耐15、9、6種藥物各4株，耐14、8種藥物各有6株，耐13種藥物有5株，耐12、11、10種藥物分離菌株最多，分別占分離菌株的16.0%、18.7%和17.3%。

表3 多重耐藥性檢測(cè)結(jié)果

2.7 毒力基因檢測(cè)

結(jié)果由4可知，分離菌株的耐藥基因blaZ、ermA、ermB、tetK、tetL、cfr、fexA、fexB檢出率較高，在30.7%～82.7%之間；耐藥基因linA、msrA、aac6-aph2、tetM檢出率在2.7%～13.0%之間；耐藥基因ermC、mphC、tetO未檢出。

表4 75株致病性金黃色葡萄球菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，在奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中，飼養(yǎng)管理不當(dāng)、擠奶及環(huán)境未進(jìn)行消毒等因素，可致該菌入侵奶牛乳房中，在乳腺細(xì)胞上生長(zhǎng)、繁殖引起炎癥、嚴(yán)重引起乳房炎[11-13]。因此，奶牛場(chǎng)中應(yīng)該注重該病的綜合防控。本研究結(jié)果表明，從2019年-2020年采集的鮮奶樣品127份中分離得到92株分離株，其中75株金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠具有致病性，以致小鼠死亡4/5只、5/5只菌株最多，說(shuō)明該地區(qū)奶牛源金黃色葡萄球菌流行嚴(yán)重，且具有很強(qiáng)的致病性。因此，在奶牛養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)該引起重視，對(duì)該病進(jìn)行綜合的防控。

臨床中奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌防治主要依靠抗菌藥物治療，由于抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致其金黃色葡萄球菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，其耐藥性也逐年增加，給該菌的防治帶來(lái)一定困難[9-11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，75株金黃色葡萄球菌分離菌株對(duì)臨床中常用的14種藥物耐藥率在45.3%以上，產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥性，耐12(16.0%)、11(18.7%)、10(17.3%)種藥物分離菌株最多。說(shuō)明該地區(qū)分離的75株金黃色葡萄球菌對(duì)常用的抗菌藥物產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥性。與張行等[9]、李托等[14]、萬(wàn)佳宏等[15]報(bào)道的金黃色葡萄球菌耐藥性存在一定差異性，與地區(qū)、環(huán)境及用藥頻率等多種因素有關(guān)。金黃色葡萄球菌耐藥性已經(jīng)較普遍，且在治療該病過(guò)程中一定合理使用藥物，減少耐藥性產(chǎn)生，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，注意環(huán)境的消毒。

國(guó)內(nèi)許多研究表明，金黃色葡萄球菌的耐藥菌株通常通過(guò)攜帶多種耐藥基因快速適應(yīng)生存環(huán)境中抗菌藥物的使用頻率而產(chǎn)生耐藥性，在金黃色葡萄球菌基因組編碼中含有多種可移動(dòng)的遺傳元件，其攜帶耐藥基因通過(guò)其水平基因的轉(zhuǎn)移而發(fā)生進(jìn)化，調(diào)控各種耐藥因子的表達(dá)產(chǎn)生耐藥性，金黃色葡萄球菌的耐藥菌株產(chǎn)生與其攜帶耐藥基因具有一定相關(guān)性[15-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，75株金黃色葡萄球菌攜帶12種耐藥基因，耐藥基因blaZ、ermA、ermB、tetK、tetL、cfr、fexA、fexB檢出率在30.7%以上，其他耐藥基因檢出率在2.7%～13.0%之間,說(shuō)明該地區(qū)分離的75株金黃色葡萄球菌攜帶多種耐藥基因。攜帶耐藥基因與耐藥性之間的相關(guān)性及產(chǎn)生耐藥機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果可為該地區(qū)奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的綜合防控提供參考。