孫 偉，劉杉杉*，周 佳，朱鋒釗，高俊波，王靖飛

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院/民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州銅仁 554300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/動物病原與病理形態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱 150069)

豬偽狂犬病 (Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一種免疫抑制性疾病[1]。PRV可感染豬、牛、羊、鼠等哺乳、反芻和嚙齒類動物，引起宿主出現(xiàn)繁殖障礙、腹瀉、瘙癢等癥狀，具有較高的死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。PRV感染引起的腦炎導(dǎo)致豬群出現(xiàn)神經(jīng)缺陷并誘發(fā)死亡[3]。研究表明，PRV均可引起豬和小鼠腦炎，并表現(xiàn)出相似的組織病理變化[4]。我國自實(shí)行PRV凈化計(jì)劃以來取得了顯著的效果，但該病仍未被根除[5]。

腦是機(jī)體內(nèi)能量需求最高和代謝最旺的的組織，富含豐富的線粒體。腦功能發(fā)揮所需的代謝能量完全依賴于線粒體結(jié)構(gòu)、功能以及線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的完整性。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)生成ATP的細(xì)胞器，在維持脂質(zhì)、氨基酸、鈣穩(wěn)態(tài)，以及調(diào)節(jié)類固醇代謝和觸發(fā)細(xì)胞凋亡過程中起到重要作用[6]。線粒體功能障礙與能量代謝降低有關(guān)，線粒體損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。腦組織是PRV作用的重要靶器官之一，PRV感染過程對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響尚缺乏文獻(xiàn)報道。因此，本研究以小鼠為模型，初步探討PRV感染對腦組織線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響，為PRV致病機(jī)理的研究提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株與實(shí)驗(yàn)動物 PRV-HLJ株(MK080279.1)由中國農(nóng)科院哈獸醫(yī)研究所動物病原與病理形態(tài)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)分離并由本實(shí)驗(yàn)室保存。6周齡Balb/c小鼠，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。將小鼠隨機(jī)分成4組(對照組18只，感染組各6只)，其中對照組皮下注射200 μL無菌 PBS，試驗(yàn)組小鼠經(jīng)皮下注射等劑量滴度為1×103TCID50/100 μL PRV溶液，觀察小鼠臨床癥狀，并分別于PRV感染后48、72、96 h處死對照組和試驗(yàn)組小鼠，取其腦組織，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 動物組織線粒體提取試劑盒( M0020)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；SYBR Green 熒光PCR 染料(RR820A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (RR047A) ，TaKaRa公司產(chǎn)品；組織RNA提取試劑盒 (B518621) 、Mt擴(kuò)增引物,上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；ATP酶檢測試劑盒 (A061-1)，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀(ZE5)、熒光定量PCR儀(CFX96)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；離心機(jī)(Heraeus X1R)，美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(H-7650),日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腦組織線粒體提取 根據(jù)組織線粒體提取試劑盒操作規(guī)程，取100 mg～200 mg新鮮腦組織，洗凈后，加入1.0 mL預(yù)冷的Lysis buffer，冰浴上用玻璃勻漿器，制備組織勻漿，離心去除組織沉淀后，將上清液經(jīng)10 000 r/min高速離心沉淀線粒體，Store buffer重懸后備用。

1.2.2 線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測 取各組小鼠新鮮的腦組織，切割成1 mm3大小， 在25 mL/L戊二醛溶液中固定2 h，洗滌后，經(jīng)10 mg/mL鋨酸固定，在500 mL/L～1 000 mL/L梯度丙酮溶液中脫水，加入樹脂過夜浸透，切割成100 nm厚度，分別經(jīng)過醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色后，在電子顯微鏡下觀察。

1.2.3 PRV對各組小鼠腦線粒體腫脹度影響的檢測 將提取的線粒體濃度調(diào)整為1×106個/mL，參考Zheng G等的方法[7]，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測分析。與流式細(xì)胞術(shù)激光束方向同軸的前向角散射(Forward scatter,FSC)，表征線粒體相對大小，與激光束垂直的側(cè)向角散射(Side scatter,SSC)，表征線粒體粒度，因此常用FSC/SSC比值判斷線粒體腫脹度。

1.2.4 PRV對線粒體ATP酶活性影響的檢測 參照試劑盒說明書，提取各試驗(yàn)組小鼠腦組織線粒體，根據(jù)ATP酶分解ATP的原理，采用比色皿法測定無機(jī)磷的含量，從而計(jì)算出線粒體中Na-K ATPase和Ca-Mg ATPase水平。

1.2.5 PRV對線粒體拷貝數(shù)影響的檢測 提取各試驗(yàn)組小鼠腦組織總RNA，參考實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法[8]，以線粒體保守基因細(xì)胞色素B (Cytb)為目的基因，以 β-actin內(nèi)參基因，通過熒光定量PCR(real-time qPCR,RT-qPCR)方法擴(kuò)增Cytb基因，并以 2ΔCt法(ΔCt=Ctβ-actin-CtCytb)計(jì)算mt DNA拷貝數(shù)。Cytb引物序列如下：

F5-TGTCGGACGAGGCTTATATTATGG/R5-TGTGGCTATGACTGCGAACAG-3。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 組間多重比較采用SPSS 21.0軟件中的One-way ANOVA模塊進(jìn)行。所得結(jié)果與對照組相比較，以*P< 0.05，**P<0.01判斷差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 PRV對線粒體腫超微結(jié)構(gòu)變化結(jié)果

與對照組比較，PRV感染后36 h個別小鼠出現(xiàn)被毛粗亂、瘙癢等臨床癥狀，48 h后癥狀明顯，60 h后個別組小鼠出現(xiàn)死亡。對各組小鼠腦組織進(jìn)行TEM檢測，結(jié)果如圖1所示。與對照組相比，PRV感染后，小鼠腦組織線粒體有濃染現(xiàn)象，電子密度加大，部分線粒體出現(xiàn)腫脹變性，嵴消失，出現(xiàn)不同程度的空泡化，其中以感染后72 h和96 h最為明顯。

A.對照組；B.48 h；C.72 h；D.96 h

2.2 PRV對線粒體腫脹度的影響結(jié)果

PRV感染小鼠后48、72、96 h，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測腦組織線粒體腫脹度變化。與對照組相比較，PRV感染后，隨著感染時間的延長，腦組織線粒體FSC/SSC逐漸增大(P<0.01，圖2)。表明PRV可以增加線粒體腫脹度。

圖2 PRV感染后對線粒體腫脹度的影響

2.3 PRV對線粒體ATP酶的影響結(jié)果

檢測結(jié)果如圖3所示，相比于對照組，PRV感染后48 h，腦組織Ca-Mg ATP酶和Na-K ATP酶出現(xiàn)了極顯著下降(P<0.01)，且具有一定的時間依賴性(48 h～96 h)。結(jié)果說明，PRV感染后腦組織線粒體ATP酶活性降低。

1.Ca-Mg ATPase活性；B.Na-K ATPase活性

2.4 PRV對mtDNA拷貝數(shù)的影響結(jié)果

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組小鼠線粒體細(xì)胞色素Cytb基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，并計(jì)算線粒體拷貝數(shù)。與對照組比較，隨著PRV感染時間的延長，線粒體拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01，圖4)。結(jié)果表明，PRV感染后可降低腦組織mtDNA拷貝數(shù)。

圖4 PRV感染對mtDNA拷貝數(shù)的影響

3 討論

腦是機(jī)體內(nèi)完全分化的器官，線粒體含量豐富，具有耗氧量大、能量代謝旺盛的特點(diǎn)。神經(jīng)遞質(zhì)釋放和突觸可塑性均依賴于線粒體代謝。線粒體障礙可造成神經(jīng)元受損，從而影響大腦所支配的機(jī)體行為[9]。因此，線粒體功能障礙在腦部疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[10]。線粒體功能障礙的前提和基礎(chǔ)是線粒體結(jié)構(gòu)的改變。PRV在感染組織周圍部位神經(jīng)元內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，經(jīng)外周神經(jīng)系統(tǒng)移行到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)免疫反應(yīng)，并造成病理損傷[11]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著PRV感染時間的延長，小鼠腦部線粒體腫脹度增加，表明PRV會引起腦組織線粒體結(jié)構(gòu)改變。研究發(fā)現(xiàn)，PRV感染會引起宿主出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)病變，并表現(xiàn)出瘙癢等臨床癥狀[12]，這可能與線粒體功能障礙有關(guān)。

線粒體是為細(xì)胞增殖、遷移和分化等多個生命活動提供能量ATP的主要細(xì)胞器，線粒體功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[13]。細(xì)胞內(nèi)ATP 酶(包括Na-K ATP酶和Ca-Mg ATP酶)活性是線粒體功能的重要指標(biāo)。ATP是一種重要的細(xì)胞外配體，在細(xì)胞自分泌、細(xì)胞間通訊和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRV感染后線粒體Ca-Mg ATP酶和Na-K ATP酶活性均出現(xiàn)顯著降低。Puma D等[15]發(fā)現(xiàn)，PRV同屬病毒單純皰疹病毒(Herpes simplex virus 1,HSV-1)通過與星形膠質(zhì)細(xì)胞的HSPGsof位點(diǎn)結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，促進(jìn)ATP釋放，為病毒感染提供能量，有助于HSV-1感染神經(jīng)元細(xì)胞。Murata T等[16]發(fā)現(xiàn)，HSV-1感染后細(xì)胞內(nèi)ATP水平可維持至少6 h，在感染后期開始下降。PRV降低ATP酶的作用位點(diǎn)，還有待于進(jìn)一步證實(shí)。

mtDNA拷貝數(shù)與線粒體基因的轉(zhuǎn)錄成正比，其數(shù)量保持相對恒定以維持能量供應(yīng)平衡，mtDNA拷貝數(shù)在一定程度上反映了細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量，是線粒體功能障礙的標(biāo)志物之一[17]。mtDNA具有不完全修復(fù)能力，主要編碼氧化磷酸化相關(guān)基因，因此更容易受到氧化損傷因子的影響[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PRV感染后mtDNA拷貝數(shù)出現(xiàn)明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)PRV可造成線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變。本試驗(yàn)在PRV感染的不同時間段檢測腦組織線粒體的結(jié)構(gòu)和功能的改變，表明PRV-HLJ株感染后，可誘導(dǎo)小鼠線粒體出現(xiàn)腫脹并降低ATP酶活性，導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)降低。本試驗(yàn)為線粒體在PRV致病機(jī)理中的作用奠定了基礎(chǔ)。然而，造成腦部線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。