王俊書，徐進強，封家旺，顧慶云，趙曉民，金紅巖*

(1.西藏職業(yè)技術學院西藏獸藥重點實驗室，西藏拉薩 850030；2.天津津墾牧業(yè)集團有限公司，天津 300380；3.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)為一種小型革蘭氏陰性球桿菌，可以廣泛感染家養(yǎng)和野生哺乳動物、鳥類和爬行動物以及人類[1]。最常見的Pm相關的6種動物疾病分別是禽霍亂、豬萎縮性鼻炎和巴氏桿菌病、反芻動物出血性敗血病(HS)和牛呼吸道疾病以及兔子的鼻息肉[2]，給動物健康和畜牧業(yè)造成嚴重損害。

多殺性巴氏桿菌可根據(jù)外莢膜的抗原性分為5個莢膜血清群(A、B、D、E和F)。莢膜在多殺性巴氏桿菌的總體毒力中起主要作用，因為缺乏莢膜會降低分離株侵入和黏附宿主細胞以及抵抗吞噬作用的能力。對于牛源Pm分離株，最常見的是莢膜血清型A型(71.0%)，其次是莢膜血清型B型(27.1%)和F型(1.9%)[3]。

通過全基因組測序和功能注釋，更深入地認識其功能基因和毒力潛在遺傳機制，快速準確地表征Pm分離株的基因型，包括莢膜、脂多糖和毒力因子編碼基因(tbpA、pfhA、toxA、hgbB、hgbA、fur、tonB、exbB、hgbB、nanH、nanB、sodA、sodC、ompA、ompH、oma87、plpB、tadD等)[4-5]，這些毒力因子在發(fā)病機理中起關鍵作用。

本研究對西藏某牦牛場病死牦牛脾臟分離的Pm進行分離鑒定和全基因組測序，通過細菌致病菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB)注釋、直系同源基因簇數(shù)據(jù)庫(Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG)注釋、綜合性抗菌藥物耐藥性數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD)注釋和KEGG數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注釋，分析其潛在毒力因子基因和耐藥基因，豐富相關研究數(shù)據(jù)，為分析西藏地區(qū)牦牛源Pm致病機理提供遺傳學支持數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 本試驗所用病料為2020年6月無菌采集于西藏某地牦牛場1頭病死牦牛的脾臟。

1.1.2 試劑 DNA標準DL 5 000、DL 2 000，2×TaqMix，細菌DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；營養(yǎng)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基，海博生物技術有限公司產(chǎn)品；各種染色試劑，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；VITEK 2 GN鑒定卡、革蘭氏陰性細菌藥敏鑒定卡，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生化培養(yǎng)箱(BC-250)，上海貝茵儀器有限公司產(chǎn)品；小型核酸電泳系統(tǒng)(DYCP-31CN)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；多功能凝膠成像系統(tǒng)(G:BOX Chemi XX9)，基因有限公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(NanoDrop One)，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；三層全溫組合搖床(QHZ-123B)常州普天儀器有限公司產(chǎn)品；梯度PCR儀(New xp)，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；VITEK 2 COMPACT全自動微生物鑒定系統(tǒng)，法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 將無菌采集的病死牦牛脾臟處理后涂于營養(yǎng)瓊脂，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)5 h～8 h，增菌液接種在營養(yǎng)瓊脂和血平板，37 ℃培養(yǎng)過夜后觀察并記錄菌落特征。

1.2.2 細菌鑒定

1.2.2.1 細菌染色 挑取單菌落進行革蘭氏染色和瑞特氏染色，鏡檢。

1.2.2.2 VITEK2全自動微生物鑒定 純化后的菌液稀釋至0.5 McF～0.63 McF，選用VITEK 2 GN鑒定卡通過VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行菌種鑒定。

1.2.2.3 16S rRNA擴增和序列分析 使用細菌DNA提取試劑盒，提取分離菌株總DNA，使用16S rRNA 通用引物進行PCR擴增，引物序列：27F：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ，1492R：5′ -ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′[6]。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。回收PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結果進行Blast比對。

1.2.2.4 血清型鑒定 根據(jù)文獻報道的5種莢膜血清型PCR鑒定方法對該菌的莢膜血清型開展鑒定[6]，引物由北京六合華大基因有限公司合成(表1)。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 多殺性巴氏桿菌莢膜血清型鑒定引物

1.2.3 基因組學分析

1.2.3.1 基因組組分 將純化后的菌液送至北京六合華大基因科技有限公司進行第二代全基因組測序。獲得基因組序列后，分析基因組上基因分布、非編碼RNA(ncRNA)和串聯(lián)重復序列(Tandem Repeat，TR)。

1.2.3.2 基因功能注釋 獲得測序菌株基因集后，對基因進行VFDB、COG、CARD、KEGG數(shù)據(jù)庫比對注釋，確定基因的功能及相關描述信息。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定結果

經(jīng)純化后，得到1株疑似多殺性巴氏桿菌的菌株，該菌株在營養(yǎng)瓊脂上形成白色、不透明、邊緣整齊的圓形小菌落，在血平板上未形成溶血環(huán)。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌，瑞特氏染色可見兩極著色(圖1)。經(jīng)VITEK2全自動微生物鑒定儀分析初步確定為多殺性巴氏桿菌。

A.革蘭氏染色；B.瑞特氏染色

2.2 16S rRNA擴增和序列分析

16S rRNA基因PCR擴增出一條約為1 500 bp的特異性條帶(圖2)，與目的條帶大小相符。膠回收產(chǎn)物經(jīng)測序后，測序結果在GenBank中進行Blast比對，結果表明，分離菌株16S rRNA基因與Pm序列同源性較高(99.6%)。將分離菌株命名為Tbs20。

M.DNA 標準DL 5 000;1.分離菌株;2.陰性對照

2.3 莢膜血清型鑒定結果

Tbs20菌株在莢膜血清型A型引物擴增出約1 000 bp的條帶，與目的條帶大小相符，而另外4種莢膜血清型引物均無條帶，由此判定Tbs20為A型多殺性巴氏桿菌(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.A型;2.B型;3.D型;4.E型;5.型F型

2.4 基因組學分析

2.4.1 基因組基本信息 分離菌株經(jīng)全基因組測序并校正序列的準確性后，基因組全長3 061 796 bp，基因數(shù)量2 852個，基因平均長度911.57 bp，C+G含量47.26%。非編碼RNA數(shù)量為116個(4.07%)，非編碼tRNA數(shù)量62個(2.17%)，非編碼5S rRNA數(shù)量1個(0.35%)，非編碼16S rRNA數(shù)量1個(0.35%)，非編碼23S rRNA數(shù)量1個(0.35%)，非編碼小RNA(sRNA)數(shù)量51個(1.79%)。重復序列數(shù)為151個(5.29%)：TRF(Tandem Repeats Finder)86個，大小在6 bp～312 bp之間，總長度為6 284 bp，占基因組比例為0.205 2%；小衛(wèi)星DNA 54個，大小在15 bp～60 bp之間，總長度為2 954 bp，占基因組比例為0.096 5%；微衛(wèi)星DNA 11個，大小在6 bp～10 bp之間，總長度為745 bp，占基因組比例為0.024 3%。

2.4.2 VFDB數(shù)據(jù)庫注釋 經(jīng)過VFDB數(shù)據(jù)庫注釋，預測分離菌株有177個毒力因子(VFGs)(6.2%)，包括莢膜、脂多糖、外膜蛋白、鐵攝取相關蛋白、Ⅸ型菌毛以及與毒力相關基因(hitA、hitC和hlyA)。

2.4.3 COG數(shù)據(jù)庫注釋 有2 395個基因(2 395/2 852，83.98%)能夠在COG數(shù)據(jù)庫中得到注釋，其中涉及信息存儲及傳遞相關的基因560個，細胞過程及信號傳遞相關基因433個，1 042個基因涉及物質代謝，而功能未知的基因則有360個。在這些類別中，涉及到僅有功能預測基因最多，然后為氨基酸代謝、核糖體結構及生物合成基因，這些基因的存在有利于分離菌株在不良環(huán)境下生長和繁殖。

2.4.4 CARD數(shù)據(jù)庫注釋 在Tbs20菌株中未發(fā)現(xiàn)任何的耐藥基因，這可能與西藏地域原因和極少使用抗菌藥物有關。

2.4.5 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 分離菌株共有2 127個基因(2 127/2 852，74.58%)進行了KEGG注釋，其分別注釋為118(5.58%)的細胞過程、154(7.24%)環(huán)境信息處理、168(7.90%)遺傳信息處理、84(3.95%)人類疾病、1 559(73.30%)新陳代謝、44(2.07%)生物體系統(tǒng)。

3 討論

本研究從西藏某牦牛場1頭病死牦牛的脾臟分離到了1株多殺性巴氏桿菌，為了分析其種群遺傳信息，對分離菌株Tbs20進行全基因組測序，從而確定了全基因組中2 395個COG基因、2 127個KEGG基因、177個毒力基因，未發(fā)現(xiàn)耐藥基因。

Pm基因組包含許多推定致病因子的編碼基因，這些致病因子促成了其發(fā)病機理，已報道的相關毒力因子包括毒素(PMT)、莢膜、OMP、LPS、鐵調節(jié)和鐵獲取蛋白、菌毛和其他黏附素[6]。這些基因中的一些廣泛存在于Pm基因組中，陳建春等于2018年在西藏那曲病死牦牛內臟中分離了13株B型多殺性巴氏桿菌，ptfA、fimA、hsf-2、pfhA、sodA、tbpA、sodC、nanH、ompA、oma87、plpB、exbB、exbD、tonB、hgbA、fur16種毒力基因檢出率為100% ，而tadD、toxA、nanB、pmHAS4種毒力基因檢出率為0，部分菌株可檢測到hsf-1、ompH、hgbB3種毒力基因[6]。

本研究檢測到分泌系統(tǒng)、莢膜、LPS、ompA、溶血素(hlyA)、血紅素生物合成(hemA、hemB、hemC、hemE、hemH、hemN、hemL)、Ⅳ型菌毛、鐵攝取蛋白(hitA和hitC)等基因，未檢測到編碼菌毛和其他黏附素(ptfA、hsf-2和tadD等)、唾液酸酶(nanB和nanH)、透明質酸(pmHAS)、外膜蛋白(oma87、plpB和ompH)和鐵攝取蛋白(tbpA、exbD、hgbA和hgbB)等基因。

Pm產(chǎn)生的LPS由高度疏水的脂質A部分、內部和外部核心寡糖主鏈2部分組成，缺乏在其他革蘭氏陰性細菌中發(fā)現(xiàn)的LPS的典型擴展O抗原結構，但在分離菌株中發(fā)現(xiàn)了編碼LPS O抗原的基因hisH2。有研究顯示，Pm脂質A生物合成和組裝所需的基因(lpxA、lpxB、lpxC、lpxD、lpxH、lpxK、lpxL、lpxM、kdsA、kdsB和kdsC)和內核寡糖(kdkA、kdtA、gmhA、gmhB、gmhC、hptA和hptB)在不同的Pm菌株之間是保守的，這些基因位于整個基因組的許多位點[7]。這些基因中編碼庚基轉移酶的基因hptA、hptB，決定了脂多糖內核的產(chǎn)生。sugC基因編碼海藻糖循環(huán)ABC轉運蛋白，有研究表明，利用海藻糖可提高某些致病菌的毒性和適應性[8]。分離株Tbs20中未發(fā)現(xiàn)皮膚壞死毒素編碼基因toxA，但檢測到了htpB，htpB是由3 858 bptoxA基因編碼的146 ku單鏈G蛋白脫酰胺毒素，可造成多發(fā)性萎縮性鼻炎和PMT。

從宿主環(huán)境中高親和力獲取鐵是致病菌毒力的必要決定因素，在人類宿主中生長的微生物必須具有獲得轉鐵蛋白螯合鐵的機制。Hansen等描述了1個鐵轉運至關重要的基因位點，由3個基因組成：周質結合蛋白(hitA)、特定的細胞質通透酶(hitB)和提供能量的核苷酸結合蛋白(hitC)。hitABC系統(tǒng)能夠在沒有Tbp1/2的情況下通過直接從擴散到周質中的來源獲取鐵來發(fā)揮作用[9]。在Tbs20中發(fā)現(xiàn)了hitC的存在，揭示了Tbs20鐵獲取機制。

Ⅳ型菌毛是最常見的細菌菌毛類型，是細、長、柔韌且可伸縮的蛋白絲。菌毛纖維由數(shù)百個PilA(或菌毛蛋白，主要結構亞基)拷貝組成，由algR調節(jié)器正向控制的操縱子編碼[10]。在Tbs20中發(fā)現(xiàn)了algR、PilA、PilB、PilC、PilG、PilH、PilI、PilJ、PilM、PilO、PilP、PilQ、PilT、PilU和PilR基因的存在。

Kong L C等[11]對中國6省多殺性巴氏桿菌的抗菌敏感性的研究顯示,Pm對許多抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，尤其是阿米卡星、磺胺甲惡唑和磺胺氯噠嗪鈉，牛長途運輸存在增加抗藥性的風險。而本分離菌株未檢測到耐藥基因的存在，與其他相關研究結果不同，這可能與西藏牦牛場牦牛幾乎不會進行長途運輸，而且較少使用抗菌藥物有關。但隨著本菌多重耐藥性的報道越來越多，提示要加大對西藏牦牛Pm耐藥性的關注，制定合理的抗菌藥物使用策略。