史玉青，趙尊福 ，陽亭亭，文永平，張煥容

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041)

禽大腸桿菌病是指由禽致病性大腸埃希氏菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的屬于幾個血清群的任何局限性或全身性感染，并且仍然是影響全球養(yǎng)禽業(yè)的最普遍的細(xì)菌性疾病之一[1]。APEC可引起多種疾病，包括敗血癥、腹膜炎和卵黃囊感染等，并且會引起死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[2]。長期以來，抗菌藥物在細(xì)菌性疾病的治療和預(yù)防中取得良好的效果，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用。但是，由于長期濫用抗菌藥物而引起的耐藥性問題正呈逐年增長趨勢，因此農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提倡了“無抗養(yǎng)殖”。在“無抗養(yǎng)殖”的壓力下，為有效控制細(xì)菌性疾病的發(fā)生和耐藥性的產(chǎn)生，尋找抗菌藥物替代品成為當(dāng)前的熱點。噬菌體是環(huán)境中天然存在的病毒，可常規(guī)控制細(xì)菌種群[3]。此外，噬菌體對特定細(xì)菌的作用，以及自我復(fù)制和自限性，使噬菌體成為控制細(xì)菌性疾病的替代品[4-5]。而且噬菌體能感染或裂解細(xì)菌，被認(rèn)為是地球上物種最豐富的生物[6-7]。噬菌體在生態(tài)系統(tǒng)中分布廣泛，不論是海水、沙漠等惡劣的環(huán)境中都可找到噬菌體的蹤跡。有研究表明，噬菌體生命力之所以如此頑強，與其輔助代謝基因的表達(dá)密切相關(guān)[8-9]。由于烈性噬菌體能夠特異性地裂解相應(yīng)宿主菌，被認(rèn)為可替代抗菌藥物用于治療細(xì)菌性疾病。噬菌體除了用于治療細(xì)菌性疾病，還可用于生物技術(shù)、生物傳感器、食品保鮮、污染修復(fù)和廢水處理等領(lǐng)域[10]。出于安全原因，如果允許噬菌體是抗菌藥物的替代方法，則需要清楚其基因組信息。本研究對從某養(yǎng)雞場污水中分離鑒定出的1株烈性大腸埃希氏菌噬菌體Bp38進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步利用該噬菌體提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大腸埃希氏菌和噬菌體的來源 O2血清型禽致病性大腸埃希氏菌，由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室從某養(yǎng)雞場病死雞實質(zhì)器官分離鑒定并保存；噬菌體Bp38，以該血清型禽致病性大腸埃希氏菌為宿主菌，從雞場的污水中分離獲得。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；酵母提取物，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；NaCl，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；瓊脂粉，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心產(chǎn)品；SM緩沖液，上海信帆生物科技有限公司產(chǎn)品；聚乙二醇PEG8000，上海雷布斯科技有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 電熱恒溫水浴鍋(HWS-24 26 28 12)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162)，上海和呈儀器制造有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺(SW-CJ-1C)，浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(Sorvall Stratos)，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床(SPH-110X24臺式)，上海世平實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體基因組的提取及測序 噬菌體Bp38接種O2血清型禽致病性大腸埃希氏菌后富集濃縮，噬菌體濃縮液用TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體的基因組，基因組含量不少于2 μg。委托賽默百合生物科技有限公司對提取的噬菌體基因組進(jìn)行全基因組測序，并對噬菌體基因組進(jìn)行拼接，得到完整的基因組序列。

1.2.2 噬菌體Bp38基因組基本特性分析 通過DNA Star軟件中的EdiSeq對測得的基因組序列進(jìn)行一般特性分析，包括基因組長度、4種堿基的組成情況及GC含 量；利用tRNAscan-SE (http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)查找基因組序列中的tRNA編碼基因，利用tRNAdb(http://rna.tbi.univie.Ac.at/forna/)在線工具對tRNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化[11]。

1.2.3 噬菌體Bp38的ORF預(yù)測及功能注釋 通過NCBI中ORF finder在線工具進(jìn)行全基因組的基因預(yù)測，將預(yù)測到的開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，用Smart Blast將氨基酸序列與已知功能的蛋白進(jìn)行比對，完成功能注釋，用SnapGene軟件對全基因組進(jìn)行可視化分析，認(rèn)識該物種的功能基因[12]。

1.2.4 噬菌體Bp38的遺傳進(jìn)化分析 選擇噬菌體全基因組序列保守區(qū)域的末端酶大亞基基因序列在NCBI中進(jìn)行比對，用MEGA7.0軟件將同源性在前10位的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，該進(jìn)化樹通過鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建，復(fù)常檢驗(Bootstrap)次數(shù)設(shè)為500次，分析并找出與噬菌體Bp38同源關(guān)系最近的噬菌體[13]。

1.2.5 Bp38溶菌酶基因的選擇壓力分析 將溶菌酶基因在NCBI進(jìn)行比對，選取同源性較高的序列，利用MEGA7.0軟件進(jìn)行多重序列比對并刪除終止密碼子，采用在線軟件Datamonkey (http://www.datamonkey.org)中的SLAC法，檢測選擇位點，根據(jù)設(shè)定P<0.1認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，當(dāng)dN/dS>1且P<0.1為正向選擇，dN/dS<1且P<0.1時為負(fù)向選擇[14]。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體Bp38基因組基本特性

噬菌體Bp38基因組序列全長170 004 bp；堿基分布為 A(30.55%)、T(31.85%)、G(18.14%)、C(19.46%)，平均GC含量為37.60%，核酸類型為雙鏈DNA(dsDNA)。Blastn結(jié)果顯示，該噬菌體為有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、Tevenvirinae屬的噬菌體成員。用tRNAscan-SE軟件預(yù)測tRNA，發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組上有2個tRNA編碼序列，分別位于163 998 bp～163 925 bp和164 078 bp～164 005 bp(表1)；第1個tRNA反密碼子為TCT，轉(zhuǎn)運精氨酸(Arg)，第2個tRNA反密碼子為CAT，轉(zhuǎn)運蛋氨酸(Met)，二級結(jié)構(gòu)如圖1。

表1 噬菌體基因組預(yù)測的tRNA

2.2 預(yù)測的噬菌體Bp38 ORF及其功能

將噬菌體Bp38基因組預(yù)測的ORF在NCBI中進(jìn)行比對，預(yù)測ORF的起始位置、具體長度和預(yù)測的功能，共預(yù)測出140個ORF，最長的ORF編碼1 277 aa，最短的ORF編碼83 aa。

根據(jù)預(yù)測的功能可將其分為5個模塊：裂解模塊、DNA包裝模塊、結(jié)構(gòu)組成模塊、假性蛋白模塊和核酸復(fù)制與調(diào)控模塊。從可視化基因組圖譜中了解到，DNA包裝模塊包括 terminase large subunit和protease inhibitor；噬菌體結(jié)構(gòu)組成模塊包括tail protein、neck protein、portal vertex protein、prohead core protein、major capsid protein、baseplate hub subunit、tail fibers protein、tail fiber attachment catalyst和sliding clamp等；核酸代謝與復(fù)制模塊包括DNA helicase、DNA ligase、putative polynucleotide kinase、thymidylate synthase、putative dihydrofolate reductase、RnaseH、DNA endonuclease IV、exonuclease、dCTP pyrophosphatase、NTP_transferase domain-containing protein、DNA polymerase、thymidine kinase、nudix hydrolase deoxynucleoside monophosphate kinase等；與噬菌體裂解功能相關(guān)的基因有tail lysozyme、T holin lysis mediator、lysozyme等，有56個假性蛋白未知其功能，需要進(jìn)一步研究。

A.編號1;B.編號2

2.3 噬菌體Bp38的進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹能更好地分gc析噬菌體Bp38與其他噬菌體的關(guān)系，選取在氨基酸水平上保守性結(jié)構(gòu)區(qū)域末端酶大亞基(terminase large subnit)基因序列，和其他同源性較高噬菌體的末端酶大亞基核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果如圖2所示，噬菌體Bp38與Escheerichiaphage ST0和Escheerichiaphage vB EcoM G2285親緣關(guān)系最近，在同一分支上；與Escheerichiaphage F2、Escheerichiaphage p000v、Escheerichiaphage mogra和Escheerichiaphage SF的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。因此可以確定噬菌體 Bp38為有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、Tevenvirinae亞科、Mosigvirus屬。

圖2 噬菌體Bp38進(jìn)化樹

2.4 Bp38溶菌酶基因的選擇壓力

利用MEGA7.0選取53條同源性較高的序列進(jìn)行比對并刪除終止密碼子，Bp38溶菌酶基因的序列經(jīng)Datamonkey檢測分析可知，共有173個氨基酸位點，有2個正向選擇位點，位于氨基酸序列的第34和第126的位置；有10個負(fù)向選擇位點，分別位于氨基酸序列42、53、59、68、98、102、103、106、122和132的位置(表2)。

表2 溶菌酶的氨基酸位點選擇壓力分析結(jié)果

3 討論

噬菌體Bp38基因組序列全長170 004 bp，平均GC含量為37.60%，核酸類型為雙鏈DNA(dsDNA)。隨著分子生物學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，噬菌體的基因組序列不斷被公布[15]。噬菌體基因組越大，其利用宿主資源的能力越強，到目前為止，公布的噬菌體全基因組序列為33 000條左右，大腸埃希氏菌噬菌體為833條，其基因組大小在3.4 kb～316 kb之間[16-18]。

噬菌體Bp38基因組中有2個tRNA編碼序列，分別轉(zhuǎn)運精氨酸(Arg)和蛋氨酸(Met)。噬菌體基因組的大小與其包含的tRNA基因數(shù)量之間存在正相關(guān)性，表明噬菌體tRNA基因可能在宿主菌翻譯蛋白質(zhì)中發(fā)揮一定作用，也可能是宿主菌經(jīng)多次復(fù)制翻譯后保留下來的[19]。目前，僅在雙鏈DNA噬菌體的基因組中發(fā)現(xiàn)了tRNA。噬菌體不但能利用宿主菌的大多數(shù)翻譯機制，也能用自己的遺傳信息對翻譯機制進(jìn)行補充，以更好地適應(yīng)生存環(huán)境。有研究表明tRNA的分布與密碼子利用情況存在顯著關(guān)系[20]。噬菌體基因組中的tRNA能彌補宿主菌中缺少的tRNA，這使得噬菌體可以提高翻譯蛋白質(zhì)的效率[21]。還有研究表明，裂解性噬菌體比溫和性噬菌體含有更多的tRNA，可能與裂解性噬菌體繁殖速度有關(guān)，因為其需要高效率地翻譯mRNA，同時也說明tRNA越多裂解性越強[22]。

噬菌體Bp38基因組共預(yù)測出140個ORF，根據(jù)預(yù)測的功能可將其分為裂解模塊、DNA包裝模塊、結(jié)構(gòu)組成模塊、假性蛋白模塊和核酸復(fù)制與調(diào)控模塊。DNA包裝模塊中的末端酶與基因組形成核酸-蛋白復(fù)合物，并與衣殼蛋白相互作用組成包裝機器，驅(qū)動基因組DNA進(jìn)入前衣殼[23]。噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白組成了噬菌體的頭部、頸部和尾部，尾部纖維蛋白有助于噬菌體吸附宿主菌，尾部附著催化劑還能在細(xì)胞壁上形成空洞，把遺傳物質(zhì)注入宿主細(xì)胞內(nèi)[24]。預(yù)測出5個與裂解功能相關(guān)的基因，其中穿孔素可在細(xì)胞膜形成跨膜通道，溶菌酶可破壞細(xì)胞壁，裂解基因的表達(dá)產(chǎn)物在噬菌體感染宿主菌和子代噬菌體從宿主菌中釋放發(fā)揮重要的作用[25]。另外，有56個假性蛋白未知其功能，還需要進(jìn)一步研究。

以末端酶大亞基的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的結(jié)果表明，噬菌體 Bp38為有尾噬菌體目、肌尾噬菌體科、Tevenvirinae亞科、Mosigvirus屬。末端酶大亞基在氨基酸水平上是保守性結(jié)構(gòu)區(qū)域，通過其基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，能更好地分析噬菌體Bp38與其他噬菌體的關(guān)系。末端酶是一類寡聚體多功能蛋白，在噬菌體DNA包裝過程中發(fā)揮重要作用，大亞基可特異性結(jié)合病毒衣殼頂角處的孔蛋白、金屬離子及ATP，具有ATP酶、核酸內(nèi)切酶和DNA解旋酶活性[26-27]。

選擇壓力是指外界施與生物體進(jìn)化過程的壓力，從而改變該過程的前進(jìn)方向，使其適應(yīng)自然環(huán)境得以存活和繁衍[28]?；蜻x擇壓力可用非同義替換率 (dN) 和同義替換率 (dS) 的比值來判斷是否有選擇壓力作用于這個蛋白質(zhì)編碼基因，如果dN/dS>1，則認(rèn)為有正選擇效應(yīng)；dN/dS=1，則認(rèn)為存在中性選擇；dN/dS<1，則認(rèn)為有純化選擇作用[29]。本研究中，噬菌體Bp38溶菌酶基因序列有173個氨基酸位點，有2個正向選擇位點，有10個負(fù)向選擇位點，溶菌酶基因經(jīng)歷外界環(huán)境選擇壓力和自身進(jìn)化壓力雙重影響，且自身進(jìn)化壓力強于外界環(huán)境選擇壓力。綜上所述，本研究闡明了大腸埃希氏菌噬菌體Bp38的分子特征，為進(jìn)一步利用該噬菌體提供了理論依據(jù)。