楊振興，李卓然，何于雯，李占鴻，李 樂，廖德芳，楊 恒，朱建波

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224)

Committee for the Taxonomy of Viruses,ICTV)第8次會議確認的一種新病毒屬[1]。病毒粒子直徑在65 nm～75 nm之間，為20面體或球形，表面具有明顯刺狀突起，基因組大小約為20 kb～21 kb，由(Seg-1～Seg-12)12個基因節(jié)段的dsRNA組成(3.8 kb～0.8 kb)，可編碼VP1～VP12共12種蛋白[2]。

BAV為東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬的代表毒株，于1987年首次從我國西雙版納地區(qū)無名熱和腦炎患者采集的腦脊液及血清樣本中分離出[3]。此后又陸續(xù)從老撾、越南、印度尼西亞等東南亞國家和中國甘肅、山西、內(nèi)蒙古、湖北等地采集的蚊蟲或庫蠓樣品中分離出[4]。并且多次直接從不明熱和病毒性腦炎患者的體液中分離到BAV和篩查到相應(yīng)的IgM和IgG抗體，這些研究結(jié)果表明了BAV可能是一種引起人類發(fā)熱和病毒性腦炎的重要新發(fā)傳染病病原，引起了國內(nèi)外病毒學(xué)家和疾病預(yù)防控制專家的廣泛關(guān)注[5-6]。MSV為一種新發(fā)現(xiàn)的蟲媒病毒，于2013年在云南省芒市采集的三帶喙庫蚊(C.tritaeniorhynchus)中首次分離并因而得名[7]，2014年在我國廣東省汕頭市濠江區(qū)采集的三帶喙庫蚊中再次分離到MSV，并于2019年首次從云南省景洪市哨兵牛的血液中分離到了MSV[8-9]。但作為新發(fā)蟲媒病毒的MSV，感染宿主動物的范圍、感染特征、對動物健康和公共衛(wèi)生的危害尚不清楚。

近年來，寨卡病毒[10]、登革病毒[11]、非洲豬瘟病毒[12]、非洲馬瘟病毒[13]等新發(fā)和再發(fā)蟲媒病毒給我國的公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)帶來了嚴重威脅。云南省地處我國西南邊陲，特有的氣候條件適合多種蟲媒病毒在人和動物之間循環(huán)傳播，BAV和MSV均首次在云南分離，提示該地區(qū)為新發(fā)蟲媒病毒病的高風(fēng)險地區(qū)[14]。因此，建立2種病毒的檢測方法，在云南省開展相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查，對保障我國養(yǎng)殖業(yè)的安全生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

目前本實驗室已建立了BAV和MSV的常規(guī)RT-PCR檢測方法[5,9]，雖然均具有準確可靠的優(yōu)勢，但常規(guī)RT-PCR耗時長，靈敏度低，擴增結(jié)束后需電泳檢測，易污染，很難在感染初期檢出病毒。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi T等在2000年發(fā)明的一種新型恒溫核酸擴增方法[15]，該方法借助具有鏈置換作用的BstDNA聚合酶幫助，可在等溫條件下進行靶序列高效快速擴增，避免了RT-PCR的梯度升降溫模式[16]。LAMP無需昂貴的儀器設(shè)備，可以根據(jù)反應(yīng)管中液體顏色的變化，通過肉眼識別即可做出判斷，做到了真正意義上的現(xiàn)場可視化快速檢測[17]。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于細菌、真菌和病毒等病原微生物的檢測，其靈敏度、特異性和時效性都有很好的體驗。但目前尚未見該方法用于BAV和MSV檢測中，本研究選擇我國分離的BAV(YNSC043)[5]和MSV(V301/YNJH/2019)[9]毒株的Seg-12序列作為靶基因，根據(jù)高保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立RT-LAMP檢測方法，為開展我國BAV和MSV的檢測與流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、昆蟲樣品 流行性出血病病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV)YNSZ/V003/2012[18]、藍舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)GDST008[19]、中山病病毒(Chuzan virus，CHUV)SZ187[20]、廣西環(huán)狀病毒(Guangxi orbivirus，GXOV)V172/GX/2015[21]、阿卡斑病毒(Akabane virus，AKAV)V287/YNSZ/2019[22]、西藏環(huán)狀病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)YNSZ/V290/2019[23]、BAV(YNSZ043)[5]和MSV(V301/YNJH/2019)[9]等蟲媒病毒由本實驗室分離保存。昆蟲樣品為采集自云南省景洪和師宗不同地區(qū)牛、羊養(yǎng)殖場的2 596只蠓蟲和蚊蟲。

1.1.2 主要試劑 WarmStart○RLAMP變色預(yù)混液(M1800)，新英格蘭生物實驗(北京)公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL 5 000和DH5α感受態(tài)細胞，TaKaRa公司產(chǎn)品；pLB零背景快速克隆試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；磁珠法病毒核酸提取試劑盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 恒溫金屬浴(Scientific)、PCR儀(ABI9700)和核酸提取儀(AutoMate Express)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(dXRS)，美國伯樂公司產(chǎn)品；紫外分光光度(UV5Nano)計，梅特勒-托利多(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計和合成 從GenBanK中下載BAV和MSV株的Seg-12基因序列，與本研究室前期分離毒株的Seg-12序列進行比對，選擇高度保守區(qū)域，利用Primer Exporer V5(http://primerexplorer.jp/e/)在線軟件設(shè)計5條特異性引物，包括1對外引物F3/B3，1對內(nèi)引物FIP/ BIP和1條環(huán)引物Floop(表1)。引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

表1 BAV和MSV的RT-LAMP檢測引物

1.2.2 核酸的提取及質(zhì)粒標準品構(gòu)建 使用磁珠法病毒RNA提取試劑盒，按照產(chǎn)品說明書方法對EHDV、BTV、CHUV、GXOV、AKAV、TIBOV、BAV和MAV毒株及昆蟲樣品進行RNA提取。標記編號后，PCR儀上95 ℃加熱5 min后迅速冰浴冷卻進行變性處理，置-70 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e利用BAV和MSV RT-LAMP的外側(cè)引物F3/B3對提取的BAV和MSV核酸進行RT-PCR擴增，將膠回收產(chǎn)物與pLB載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞后，篩選、鑒定正確重組質(zhì)粒，并進行測序驗證。經(jīng)紫外分光光度計測定質(zhì)粒核酸濃度后，根據(jù)公式計算出核酸拷貝數(shù)。

1.2.3 可視化RT-LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別以BAV和MSV核酸為模板，參照試劑盒推薦的反應(yīng)體系(25 μL)：WarmStart LAMP 2× Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)3/ B3引物(10 μmol/L)各1 μL，F(xiàn)IP/ BIP 引物(20 μmol/L)各1 μL，F(xiàn)loop(20 μmol/L)1 μL，模板核酸2 μL，加入無核酸酶滅菌水至25 μL；在此反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，利用棋盤法分別優(yōu)化內(nèi)外引物比例(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、反應(yīng)溫度(60、62、64、66 ℃)，反應(yīng)時間(40、50、60 min)，核酸模板(1、1.5、2 μL)確定每種病毒檢測的最佳反應(yīng)體系和條件。

1.2.4 特異性試驗 取EHDV、BTV、CHUV、GXOV、TIBOV、BAV和MSV等蟲媒病毒的核酸為模板，以ddH2O為陰性對照，分別用建立的BAV和MSV RT-LAMP方法同時進行檢測，分析2種方法的特異性。

1.2.5 敏感性試驗 分別將已經(jīng)測定核酸拷貝數(shù)的BAV和MSV重組質(zhì)粒用無核酸酶滅菌水10倍梯度稀釋成100～106拷貝/μL的7個濃度梯度，每個反應(yīng)管加入1 μL稀釋的質(zhì)粒樣品作為模板，分別進行BAV及MSV的RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR[5,9]檢測，反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳，分析比較2種方法的敏感性。

1.2.6 昆蟲樣品檢查 分別用BAV和MSV的RT-LAMP及常規(guī)RT-PCR方法[5,9]同時檢測2 596份蠓蟲和蚊蟲的核酸樣品，反應(yīng)結(jié)束后進行凝膠電泳，比較2種方法的檢出率，并計算二者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標準品的構(gòu)建

經(jīng)紫外分光光度計測定構(gòu)建的BAV和MSV基因重組質(zhì)粒pLB-BAV/043/Seg-12和pLB-MSV/V301/Seg-12的核酸濃度分別為29.2 ng/μL和41.8 ng/μL，根據(jù)公式計算出核酸拷貝數(shù)分別為1.37×1011拷貝/μL和1.9×1011拷貝/μL。

2.2 可視化RT-LAMP反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化

經(jīng)棋盤法確定2種病毒優(yōu)化后的RT-LAMP反應(yīng)體系(25 μL)：Warm Start LAMP 2× Master Mix 12.5 μL，F(xiàn)3/PB3引物(10 μmol/L)各0.2 μL，F(xiàn)IP/BIP 引物(20 μmol/L)各0.4 μL，F(xiàn)loop(20 μmol/L)0.4 μL，模板核酸1.5 μL，加入無核酸酶滅菌水至25 μL；反應(yīng)條件為64 ℃ 50 min，80 ℃ 5 min終止反應(yīng)。RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，核酸樣品反應(yīng)液顏色由粉紅色變?yōu)辄S綠色，電泳呈現(xiàn)梯度狀條帶，為陽性；而陰性對照的反應(yīng)液仍為粉紅色，電泳無條帶出現(xiàn)，為陰性(圖1)，表明優(yōu)化所得BAV和MSV RT-LAMP可視化反應(yīng)結(jié)果良好。

M.DNA 標準DL 5 000;1.陰性對照；2.芒市病毒；3.陰性對照；4.版納病毒

2.3 特異性試驗

用建立的BAV和MSV RT-LAMP分別對TIBOV、EHDV、BTV、CHUV、GXOV、BAV和MSV的核酸進行檢測，結(jié)果顯示僅有BAV(圖2)和MSV(圖3)核酸檢測結(jié)果出現(xiàn)梯度狀條帶，反應(yīng)管顏色變?yōu)辄S綠色，顯現(xiàn)為陽性，而其他病毒的檢測結(jié)果均為陰性，同時，兩種病毒的檢測方法間也無交叉反應(yīng)，表明建立的BAV和MAV RT-LAMP均具有較強的特異性。

M.DNA 標準DL 5 000;1.藍舌病病毒；2.流行性出血病病毒；3.阿卡斑病毒；4.廣西環(huán)狀病毒；5.中山病病毒；6.芒市病毒；7.版納病毒；8.西藏環(huán)狀病毒

M.DNA 標準DL 5 000;1.藍舌病病毒；2.流行性出血病病毒；3.阿卡斑病毒；4.廣西環(huán)狀病毒；5.中山病病毒；6.芒市病毒；7.版納病毒；8.西藏環(huán)狀病毒

2.4 敏感性試驗

分別用無核酸酶滅菌水10倍梯度稀釋BAV和MSV基因重組質(zhì)粒成1.37×100～1.37×106拷貝/μL和1.9×100～1.9×106拷貝/μL的7個濃度梯度，各取1 μL為模板同時進行RT-LAMP和RT-PCR檢測。結(jié)果顯示RT-PCR(圖4A和圖5A)分別檢出BAV和MSV的最低核酸拷貝數(shù)分別為137拷貝/μL和190 拷貝/μL，RT-LAMP(圖4B和圖5B)分別檢出BAV和MSV的最低核酸拷貝數(shù)分別為13.7拷貝/μL和19.0拷貝/μL，但RT-PCR的電泳條帶較弱，表明RT-LAMP較RT-PCR靈敏至少高10倍以上。

A.常規(guī)RT-PCR；B.RT-LAMP；M.DNA 標準DL 5 000;N.陰性對照；0～6.陽性質(zhì)粒10倍倍比稀釋至100 拷貝/μL～106 拷貝/μL的7個梯度樣品

A.常規(guī)RT-PCR；B.RT-LAMP；M.DNA 標準DL 5 000;N.陰性對照；0～6.陽性質(zhì)粒10倍倍比稀釋至100 拷貝/μL～106 拷貝/μL的7個梯度樣品

2.5 昆蟲樣品的檢查

分別用BAV和MSV的RT-LAMP和常規(guī)RT-PCR同時檢查2 596份蠓蟲和蚊蟲的核酸樣品。BAV結(jié)果顯示(表2)，RT-LAMP檢測77份為陽性，檢出率為2.97%；RT-PCR檢測29份為陽性，檢出率為1.12%；2種方法檢測同為陽性和陰性的樣品各為29份和2 519份，符合率為[(29+2 519)/2 596]×100%=98.15%。MSV結(jié)果顯示(表3)，RT-LAMP檢測61份為陽性，檢出率為2.35%；RT-PCR檢測25份為陽性，檢出率為0.96%；2種方法檢測同為陽性和陰性的樣品各為25份和2 535份，符合率為[(25+2 535)/2 596]×100%=98.61%。以上結(jié)果表明RT-PCR雖能用于檢測昆蟲樣品中的病毒核酸，但因敏感性較RT-LAMP低，導(dǎo)致部分病毒載量較低的陽性樣品檢查結(jié)果為陰性。

表2 BAV RT-LAMP和RT-PCR檢測結(jié)果

表3 MSV RT-LAMP和RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

近年來隨著人們對東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬病毒的深入研究，不斷有新型病毒被陸續(xù)分離和發(fā)現(xiàn)[1]，這一方面拓展了人們對該病毒屬病毒的認識，另一方面掌握其新發(fā)病毒的流行特征在動物疫病防控與保障公共衛(wèi)生安全中的重要意義。東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬病毒的基因節(jié)段Seg-12，編碼病毒基因組RNA結(jié)合蛋白VP12，該基因節(jié)段在東南亞十二節(jié)段RNA病毒屬的同種病毒間高度保守，而在不同種病毒間變異度較大，是用于鑒定病毒的理想靶基因[24-25]。因此本研究根據(jù)BAV和MSV基因節(jié)段Seg-12的保守區(qū)設(shè)計特異性引物，建立了RT-LAMP檢測技術(shù)，完善了2種病毒的檢測技術(shù)體系。

本研究針對BAV和MSV的靶片段分別設(shè)計了5條特異性引物，提高了擴增效率，增加了擴增產(chǎn)物，相對降低了鈣黃素的抑制率。同時，使用含鈣黃素的預(yù)混染料，在反應(yīng)結(jié)束后，就可以直接觀察對比顏色變化，判斷待測樣品的陰性或陽性。陽性樣品管會出現(xiàn)明亮的黃綠色，而陰性樣品管為粉紅色，通過與陰性對照比較，在自然光下肉眼識別就可以做出判定。這樣就避免了采用電泳等開管方式檢測時，容易使擴增產(chǎn)物氣溶膠溢出，污染實驗環(huán)境從而出現(xiàn)假陽性的可能。由于RT-LAMP比RT-PCR的擴增效率高，開管檢測的方式更容易引起實驗的污染，這是RT-LAMP技術(shù)在基層推廣中遇到的最大問題[26]。

TIBOV、EHDV、BTV、CHUV和GXOV均為蠓蟲或蚊蟲傳播的蟲媒病毒，自然環(huán)境中多種蟲媒病毒流行區(qū)域重疊或同時感染易感動物的現(xiàn)象較普遍[27]。因此，為確保RT-LAMP檢測方法的特異性，我們將以上5種病毒的核酸同時進行檢測，結(jié)果均為陰性，表明本研究建立的RT-LAMP檢測方法具有較好的特異性。同時通過引入1條環(huán)引物，摸索最佳擴增溫度，提高了RT-LAMP的反應(yīng)效率，進一步縮短反應(yīng)時長，加速顯色反應(yīng)，分別以BAV和MSV質(zhì)粒為檢測對象，其最低檢出限分別為13.7拷貝/μL和19.0拷貝/μL，反應(yīng)時間僅為RT-PCR的一半，敏感性是RT-PCR方法的10倍以上。

昆蟲樣品檢測結(jié)果顯示，因為RT-LAMP的靈敏度更高，而陽性昆蟲樣品的病毒載量較低，所以導(dǎo)致RT-LAMP對2種病毒的檢出率均是常規(guī)RT-PCR方法的2倍以上。同時發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測昆蟲樣品時，擴增產(chǎn)物的電泳條帶較弱，可能導(dǎo)致一些樣品檢測時出現(xiàn)假陰性。因此,RT-LAMP有更好的靈敏度和時效性，更適合大規(guī)模樣品的快速檢測和病原學(xué)調(diào)查，所以本研究建立的RT-LAMP為我國開展BAV和MSV的流行病學(xué)調(diào)查和疫病的現(xiàn)場快速檢測提供了一種有效的技術(shù)手段。