楊 婧，王歡歡，劉 野，李文忠，石青青，付旭彬，李留安*，孫英峰*

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)墾康嘉生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，天津 300380；3.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，天津 300308)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、仔豬呼吸系統(tǒng)癥狀和高病死率的接觸性傳染病[1]。PRRSV于1987年首先在美國(guó)豬群中暴發(fā)，迅速在全球蔓延[2-3]。1996年在國(guó)內(nèi)首次分離報(bào)道[4]，2006年高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)在江西地區(qū)發(fā)生后，迅速蔓延至全國(guó)大部分省份，給豬場(chǎng)造了成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]。

PRRSV屬動(dòng)脈炎病毒科，單股正鏈RNA，大小約15 kb，共有9個(gè)開放閱讀框(ORF)[6]。ORF1a和ORF1b主要編碼病毒的復(fù)制酶，約占據(jù)病毒基因組的80%。ORF2-ORF7編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白[7]。按其遺傳差異和抗原性差異，可分為歐洲型(基因1型)與美洲型(基因2型)。兩型之間具有較大的差異，其核酸序列和氨基酸同源性分別為55%～70%和50%～80%[8]。HP-PRRSV屬于基因2型，在Nsp2存在不連續(xù)的30個(gè)氨基酸缺失[9-11]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)分離的TJxq1701株進(jìn)行分離鑒定、全基因測(cè)序和遺傳變異分析，研究其與參考毒株之間的遺傳演化關(guān)系，揭示我國(guó)當(dāng)前流行的PRRSV的抗原特點(diǎn)和變異規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料與細(xì)胞 天津某豬場(chǎng)的發(fā)病豬血清；Marc-145細(xì)胞由天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 One Step RNA RT-PCR試劑盒(AMV)、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T Vector載體和質(zhì)粒提取試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)用MEM液，北京索萊寶生物工程有限公司產(chǎn)品；10×PCR buffer、DNA Ladder Marker、DNTPS、Taq酶，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 PCR儀(S-1000)、凝膠成像儀(ChemiDOCXRS+)、恒壓水平電泳儀，美國(guó)Bio-Rad有限公司產(chǎn)品；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；雙人凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2D)，蘇凈凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；正倒置一體顯微鏡(Echo RVL-100-G),麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]合成全基因組擴(kuò)增引物?；蛐蛄型葱詫?duì)比分析參考毒株(表1)。

表1 同源性序列分析用參考毒株名稱及來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 病毒分離與傳代 將發(fā)病豬血清用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，接種Marc-145細(xì)胞，盲傳3代，觀察細(xì)胞病變。將病毒培養(yǎng)物接種Marc-145細(xì)胞單層，37 ℃孵1 h，加入含100 mL/L FBS培養(yǎng)液于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)48 h～72 h，出現(xiàn)75%細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收毒，凍融3次后進(jìn)行病毒傳代，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫熒光檢測(cè)(IFA) 取96孔單層細(xì)胞Marc-145細(xì)胞板，加入稀釋的病毒分離液，培養(yǎng)36 h～48 h；棄上清，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，室溫固定；棄去上清乙醇，PBS洗滌；加入PRRSV N蛋白單克隆抗體，37 ℃孵育，PBS洗滌，再加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2溫箱中孵育，在倒置熒光顯微鏡下觀察特異性的黃綠色熒光。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按RNA提取試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行病毒RNA的提?。话捶崔D(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.4 RT-PCR擴(kuò)增 應(yīng)用所設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)RT-PCR條件的優(yōu)化，分別擴(kuò)增出各目的基因片段，大小與預(yù)期片段一致。使用5′RACE和3′RACE方法擴(kuò)增出該毒株的5′和3′末端序列。

1.2.5 目的片段回收純化及克隆測(cè)序 回收純化PCR產(chǎn)物，將其pMD18-T Vector連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞；挑單菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行序列的測(cè)定。利用Lasergene的SeqMan軟件，將13個(gè)測(cè)序片段拼接，并利用Lasergene的MegAlign軟件進(jìn)行同源性分析，利用MEGA6.0軟件進(jìn)行全基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離

樣品接種Marc-145細(xì)胞盲傳3代，第2天出現(xiàn)CPE，病變細(xì)胞呈圓縮、聚堆、拉網(wǎng)、破碎，對(duì)照細(xì)胞無(wú)明顯變化(圖1)。

A.正常Marc-145細(xì)胞，B.樣品在Marc-145細(xì)胞上CPE

2.2 IFA檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TJxq1701分離毒株的Marc-145細(xì)胞存在綠色熒光信號(hào)，而空白Marc-145細(xì)胞未檢測(cè)出熒光信號(hào)(圖2)，結(jié)果表明TJxq1701分離毒株為PRRSV。

A.陰性對(duì)照；B.IFA結(jié)果

2.3 全基因組分段擴(kuò)增與克隆

經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出TJxq1701株全基因組各段的特異性條帶，長(zhǎng)度均為1 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。分別將各段回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T Vector中，通過(guò)質(zhì)粒PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～13.分片段擴(kuò)增片段

2.4 全基因組序列比較和分析

TJxq1701全基因組序列拼接，結(jié)果表明，TJxq1701毒株基因組長(zhǎng)度為15 321 nt(不含polyA)。同源性對(duì)比發(fā)現(xiàn),TJxq1701在分子遺傳演化上與HP-PRRSV參考毒株JXA1和JXA1-P80的核酸同源性分別為99.2%和99.7%，與CH-la和VR2332的同源性為95.1%和89.5%，與NADC30同源性為84.4%，而與Lelystad virus(LV)株的同源性僅為61.0%。基于TJxq1701全基因組的核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析，進(jìn)一步證實(shí)了分離病毒TJxq1701與HP-PRRSV 處于同一遺傳進(jìn)化分支，且與HP-PRRSV疫苗毒株(JXA1-P80)遺傳關(guān)系最相近，屬于HP-PRRSV類群(圖4)。

圖4 基于全基因組核苷酸序列構(gòu)建分離毒株TJxq1701遺傳進(jìn)化樹

2.5 氨基酸位點(diǎn)分析

對(duì)TJxq1701毒株各結(jié)構(gòu)基因及推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(表2)，發(fā)現(xiàn)各結(jié)構(gòu)基因之間存在不同程度的差異，但在Nsp1-3(239、686、782、958、981、1092、1158、1185、1659)、Nsp9-10(423、847、1036)、Gp2(23、50、251及Gp3(79)存在至少16處以上與JXA1-P80相同的特征性位點(diǎn)突變，推測(cè)該分離毒株為JXA1-P80遺傳演化毒株(類JXA1-P80毒株)。

表2 分離毒株TJxq1701與JXA1和JXA1-P80氨基酸位點(diǎn)分析

3 討論

PRRSV有2個(gè)基因型，即VR-2332株為代表的美洲型2型和以LV株為代表的歐洲1型。目前，我國(guó)分離鑒定的毒株多為2型的PRRSV毒株。而2型的PRRSV毒株又可分為5個(gè)亞群，第1個(gè)亞群以VR-2332位代表，第2個(gè)亞群以CH-la為代表，第3個(gè)亞群以HP-PRRSV毒株(JXA1、HuN4、TJ等)或類HP-PRRSV減毒活疫苗(JXA1-P80、TJm-F92等)為代表，第4個(gè)亞群以NADC30為代表，第5個(gè)亞群以NADC34為代表[13-14]。通過(guò)序列比對(duì)和遺傳進(jìn)化分析，確定我們分離的毒株是基因2型PRRSV毒株，且是處于第3個(gè)亞群分支，與HP-PRRSV減毒活疫苗(JXA1-P80)同源性最高。

在2006年暴發(fā)的“高熱綜合征”后出現(xiàn)HP-PRRSV，我國(guó)學(xué)者加快了相應(yīng)疫苗的研發(fā)。自2010年后，HP-PRRSV商品化減毒活疫苗，如JXA1(P80)、HuN4-F112(P120)和TJM(P90)等，在國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)廣泛應(yīng)用，對(duì)HP-PRRSV防控起到積極作用[15-16]。由于部分豬場(chǎng)生物安全不到位及HP-PRRSV減毒活疫苗無(wú)序使用，個(gè)別豬場(chǎng)存在多毒株混合免疫現(xiàn)象，造成病毒重組或者疫苗毒株遺傳變異[17-18]。對(duì)分離毒株氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，TJxq1701株具有JXA1-P80特征性氨基酸突變，即K293(Nsp1)、D686(Nsp1)、T782(Nsp2)、V958(Nsp2)、R981(Nsp2)、M1092(Nsp2)、A1158(Nsp2)、M1185(Nsp2)、D1659(Nsp3)、G423(Nsp9)、H847(Nsp10)、T1036(Nsp10)、F23(Gp2)、S50(Gp2)、F251(Gp2)、N79(Gp3)，可以預(yù)測(cè)TJxq1701株屬JXA1-P80遺傳演化毒株(類JXA1-P80毒株)。

在本研究中，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離到的PRRSV毒株TJxq1701進(jìn)行了全基因序列分析、同源性比較和遺傳進(jìn)化分析，確定了該毒株的來(lái)源與遺傳變異情況，同時(shí)也豐富了PRRSV分離株的全基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)，加強(qiáng)臨床監(jiān)測(cè)及分子流行病學(xué)研究，及時(shí)掌握日益復(fù)雜的流行毒株及其遺傳變異特點(diǎn)，對(duì)選擇有效的疫苗以及采取其他有針對(duì)性的防控措施具有重要意義。